兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞EB病毒DNA載量檢測(cè)在病情評(píng)估中的臨床意義

蔡勉珊 方炳雄 黃麗旋 游麗莎 秦澤鴻 謝 城

1.廣東省普寧市人民醫(yī)院兒科，廣東普寧 515300；2.廣東省普寧市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東普寧 515300

EB 病 毒（Epstein-barr virus， EBV）為 雙 鏈DNA病毒，是一種嗜人B淋巴細(xì)胞病毒。EBV感染是兒科比較常見(jiàn)的一類病毒性傳染病，感染時(shí)，癥狀輕重不一，多以扁桃體炎、淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大為主要臨床特征[1-2]。兒童多數(shù)語(yǔ)言表達(dá)困難，增加了EBV感染患兒的診斷難度。臨床特征結(jié)合實(shí)驗(yàn)室輔助檢查，有助于病情評(píng)估，預(yù)測(cè)臨床轉(zhuǎn)歸情況。外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell， PBMC）EB 病毒載量檢測(cè)，可準(zhǔn)確、靈敏地反映患兒EBV感染情況，較早期提示預(yù)測(cè)病情的程度[3]。

本研究運(yùn)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（Fluorescent quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）檢測(cè)兒童PBMC中EBV載量，統(tǒng)計(jì)2016年1月～ 2017年12月本院兒科收治的1171例發(fā)熱患兒， 不同年齡段EBV檢測(cè)陽(yáng)性率。

將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的146例EBV陽(yáng)性患兒，以EBV載量中位數(shù)，分為高病毒載量組和低病毒載量組，分析不同組患兒的臨床資料和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。旨在探討兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞EB病毒DNA載量檢測(cè)在病情評(píng)估中的臨床意義，以供臨床實(shí)踐參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

（1）2016年1月～2017年12月本院兒科收治的1171例發(fā)熱兒童，其中男729例，女442例；年齡0～14歲。（2）146例患兒EBV檢測(cè)陽(yáng)性，并且符合納入標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)病毒載量檢測(cè)結(jié)果中位數(shù)：1.13×104copy/mL（1.13×104拷貝 /mL），分為高病毒載量組和低病毒載量組。低病毒載量組有73例患兒，其中男49例，女24例，年齡（3.54±2.28）歲；EBV 載 量：6.06×103±1.67×103copy/mL；高病毒載量組有73例患兒，其中男47例，女26例，年齡（3.49±2.57）歲；EBV載量：2.30×105±7.72×105copy/mL。兩組患兒年齡和性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）證實(shí)為肺炎支原體、巨細(xì)胞病毒、腺病毒、肝炎病毒、風(fēng)疹病毒、腸道病毒71型、柯薩奇病毒等病毒感染；（2）有血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)基礎(chǔ)疾病；（3）臨床資料或?qū)嶒?yàn)室指標(biāo)不齊全。

1.2 研究方法

采用cobasz 480全自動(dòng)熒光PCR儀檢測(cè)發(fā)熱患兒的外周血單個(gè)核細(xì)胞EBV載量；采用瑞氏染色法，檢測(cè)患兒的外周血異常淋巴細(xì)胞比例；采用SYSMEX-5000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)患兒血常規(guī)；采用貝克曼AU5821生化分析儀檢測(cè)患兒相關(guān)生化指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）檢測(cè)發(fā)熱患兒EBV載量，分析不同年齡組的EBV陽(yáng)性檢測(cè)率。（2）記錄高、低病毒載量組患兒的咳嗽、扁桃體炎、淋巴結(jié)腫大、眼瞼水腫、肝臟腫大、脾臟腫大等臨床特征的發(fā)生率。（3）抽取高、低病毒載量組患兒的靜脈血置于乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝的試管中，瑞氏血細(xì)胞染色，顯微鏡下，計(jì)數(shù)外周血中200白細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)異常淋巴細(xì)胞的比例，同時(shí)檢查白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（LYMPH#）、淋巴細(xì)胞比例（LYMPH%）、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（MONO#）、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（MONO%）、血紅蛋白含量（HGB）和血小板計(jì)數(shù)（PLT）。（4）抽取高、低病毒載量組患兒的靜脈血置于無(wú)抗凝劑真空試管中，檢查血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽汁酸（TBA）、乳酸脫氫酶（LD）、乳酸脫氫酶同工酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CKMB）和C-反應(yīng)蛋白（CRP）水平，比較兩組差異；（5）分析高、低病毒載量組患兒熱退時(shí)間、住院天數(shù)等臨床轉(zhuǎn)歸情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件多數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率（%），計(jì)量資料用（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)比較，正態(tài)分布資料采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)熱患兒的EBV載量檢測(cè)結(jié)果

1171例發(fā)熱患兒中，238例患兒EBV檢測(cè)陽(yáng)性，總陽(yáng)性檢測(cè)率為20.32%。不同年齡段兒童EBV陽(yáng)性檢測(cè)率，如表1所示。

發(fā)熱兒童中，男童為729例，EBV陽(yáng)性檢測(cè)率為20.16%；EBV女童為442例，EBV陽(yáng)性檢測(cè)率為20.59%，不同性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），如表2所示。

發(fā)熱患兒中， ≤7歲兒童的EBV陽(yáng)性檢測(cè)率為22.06%，＞7歲兒童為8.61%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），如表3所示。

933例EBV檢測(cè)陰性的發(fā)熱患兒，臨床診斷為傳染性單核細(xì)胞增多癥（IM）有5例；238例EBV檢測(cè)陽(yáng)性的發(fā)熱患兒，疾病診斷為IM有23例。EBV檢測(cè)陽(yáng)性與IM存在相關(guān)性，如表4所示。

表1 不同年齡段兒童EBV陽(yáng)性檢測(cè)率

表5 高、低病毒載量組患兒的臨床特征[n（%）]

表6 高、低病毒載量組患兒的外周血常規(guī)指標(biāo)

表2 不同性別EBV陽(yáng)性檢測(cè)率比較

表3 ≤7歲和＞7歲兒童EBV陽(yáng)性檢測(cè)率比較

表4 EBV與IM相關(guān)性比較

2.2 高、低病毒載量組患兒的臨床特征

EBV高病毒載量組患兒的扁桃體炎、淋巴結(jié)腫大發(fā)生率比低病毒載量組患兒高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05） 。兩組患兒的咳嗽、眼瞼水腫、肝臟腫大和脾臟腫大臨床特征發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如表5所示。

2.3 高、低病毒載量組患兒外周血常規(guī)指標(biāo)

EBV高病毒載量組患兒的外周血中異常淋巴細(xì)胞的比例、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（LYMPH#）和淋巴細(xì)胞比例（（LYMPH%）均比低病毒載量組患兒高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05） 。

兩組患兒的白細(xì)胞總數(shù)（WBC） 、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（MONO#）、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（MONO%）、血紅蛋白含量（HGB）和血小板計(jì)數(shù)（PLT）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如表6所示。

2.4 高、低病毒載量組患兒生化指標(biāo)

EBV高病毒載量組患兒血清中的總膽汁酸（TBA）、乳酸脫氫酶（LD）、乳酸脫氫酶同工酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平均比低病毒載量組患兒高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 兩組患兒血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和C-反應(yīng)蛋白（CRP）水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如表7所示。

表7 高、低病毒載量組患兒生化指標(biāo)

2.5 高、低病毒載量組患兒臨床轉(zhuǎn)歸情況

EBV載量高低與臨床轉(zhuǎn)歸情況相關(guān)，高病毒載量組患兒的熱退時(shí)間和住院天數(shù)均比低病毒載量組患兒長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05） 。如表8所示。

表8 高、低病毒載量組患兒臨床轉(zhuǎn)歸情況（d）

3 討論

臨床上，發(fā)熱是兒科最常見(jiàn)的首發(fā)臨床表現(xiàn)。兒童發(fā)熱的原因，大多為感染引起，其中EBV病毒感染是兒科常見(jiàn)的感染性疾病，臨床癥狀多變，病情輕重不一，評(píng)估困難。我國(guó)制定EB病毒-IM診斷標(biāo)準(zhǔn)，需要滿足發(fā)熱、咽扁桃體炎、淋巴結(jié)腫大，肝臟腫大等臨床指標(biāo)，還需要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)輔助證據(jù)[2]。目前多種方法用于檢測(cè)EBV感染，存在檢測(cè)率低，假陽(yáng)性率高等缺點(diǎn)[3]。

牟文鳳[4]發(fā)現(xiàn)外周血單個(gè)核細(xì)胞EBV載量檢測(cè)結(jié)果均比血漿DNA和血清學(xué)結(jié)果陽(yáng)性率高，該方法更加適合于懷疑EBV感染的嬰幼兒及免疫異常患者。選擇合理、有效的檢測(cè)方法，是目前研究的重點(diǎn)。

熒光定量PCR技術(shù)是檢測(cè)EBV-DNA，比較可靠、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)技術(shù)，能較好地反映患兒的感染情況，根據(jù)病毒載量的高低，可作為臨床醫(yī)生判斷患兒病情評(píng)估的指標(biāo)[5]。本研究，通過(guò)采取患兒外周血于乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝管中，用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，使用熒光定量PCR方法，檢測(cè)患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞EBV-DNA載量。

我國(guó)兒童EBV感染以4～6歲年齡段為最高[6]。鄭煒琨等[7]經(jīng)過(guò)篩選條件：反復(fù)或間斷發(fā)熱≥2周等條件，得出可疑EBV感染患兒陽(yáng)性檢測(cè)率為24.08%。洪潔玲[8]發(fā)現(xiàn)201例發(fā)熱患兒，EBV陽(yáng)性率為18.9%。本研究，兒科1171例發(fā)熱患兒中，238例患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞的EBV檢測(cè)陽(yáng)性，總陽(yáng)性檢測(cè)率為20.32%。表明發(fā)熱患兒中20.32%是由EBV感染或合并感染引起，男童和女童EBV檢測(cè)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），≤7歲兒童的EBV陽(yáng)性檢測(cè)率為22.06%，比＞7歲兒童高（P ＜0.05）。

根據(jù)我國(guó)IM臨床判斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，本研究中，933例EBV檢測(cè)陰性的患兒中，有5例患兒符合IM診斷標(biāo)準(zhǔn)；而238例患者EBV檢測(cè)陽(yáng)性的患兒，疾病診斷為IM有23例。因此，外周血單個(gè)核細(xì)胞EBV病毒DNA載量檢測(cè)，可作為兒童病情評(píng)估的臨床指標(biāo)。

中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)感染學(xué)組和全國(guó)兒童EB病毒感染協(xié)作組報(bào)道，兒童非腫瘤性EBV感染疾病主要包括傳染性單核細(xì)胞增多癥（IM），慢性活動(dòng)性EBV感染（CAEBV）和EBV相關(guān)噬血細(xì)胞性淋巴組織增生癥（EBV-HLH）[2]。

EBV感染臨床癥狀特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)結(jié)果，要注意鑒別肺炎支原體、巨細(xì)胞病毒、肝炎病毒等相關(guān)病毒的影響[2]。本研究排除合并支原體、或其他已知的非EB病毒的患兒，符合納入標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)EBV檢測(cè)陽(yáng)性的患兒有146例。根據(jù)病毒載量檢測(cè)結(jié)果中位數(shù)：（1.13×104）copy/mL，分為高病毒載量組和低病毒載量組。

EBV感染患兒存在發(fā)熱、咽峽炎、扁桃體炎、淋巴結(jié)腫大等的臨床特征[9]。本研究，高病毒載量組患兒的扁桃體炎發(fā)生率為45.21%、淋巴結(jié)腫大發(fā)生率為50.68%，均比低病毒載量組患兒高。EBV患兒出現(xiàn)外周血異常淋巴細(xì)胞比例增加的檢查結(jié)果[7，10]。徐福勝[11]發(fā)現(xiàn)，發(fā)熱患兒出現(xiàn)血清腺苷酸及異型淋巴細(xì)胞比例升高，提示有可能EBV病毒感染。本研究，高病毒載量組患兒的外周血中異常淋巴細(xì)胞的比例為6.55%、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)6.14×109/L和淋巴細(xì)胞比例為47.71%，均比低病毒載量組患兒高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著EBV載量的增加，患兒的臨床特征更加明顯，能在外周血常規(guī)指標(biāo)體現(xiàn)出來(lái)。

EBV感染患兒后，異常淋巴細(xì)胞及病毒浸潤(rùn)相應(yīng)臟器，導(dǎo)致全身臟器發(fā)生病理學(xué)改變，表現(xiàn)出各種臨床特征和相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[12-13]。本研究，高病毒載量組患兒血清中的總膽汁酸（TBA）、乳酸脫氫酶（LD）、乳酸脫氫酶同工酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平均比低病毒載量組患兒高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。EBV載量增加，患兒的肝功能、心臟功能生化指標(biāo)水平隨之升高，提示臟器受損程度加重。

李海峰[14]發(fā)現(xiàn)，干擾素聯(lián)合更昔洛韋治療患兒EBV感染比單用更昔洛韋療效更加顯著。本研究，按照指南[2，15]標(biāo)準(zhǔn)治療EBV感染患兒，高病毒載量組患兒的熱退時(shí)間為4.67d和住院天數(shù)為8.80d，均比低病毒載量組患兒長(zhǎng)（P＜0.05）。因此，EBV載量高低在患兒臨床轉(zhuǎn)歸中，起到重要影響因素。

綜上所述，兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞EB病毒DNA載量與患兒的疾病的嚴(yán)重程度成正相關(guān)，表現(xiàn)在患兒的臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，影響患兒的臨床轉(zhuǎn)歸情況。因此外周血單個(gè)核細(xì)胞EB病毒DNA載量檢測(cè)在兒童病情評(píng)估和預(yù)后判斷有一定的臨床意義，可為臨床醫(yī)生的診療提供參考。