量子點與牛血清白蛋白相互作用的光譜研究

袁旺秋

【摘 要】生物體內(nèi)包含大量蛋白質(zhì)，是人體中最重要的組成部分，它是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，在體內(nèi)有著極其重要的作用，通常需要依靠探針試劑對蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。半導(dǎo)體量子點有熒光產(chǎn)率高、熒光發(fā)射光譜帶窄、熒光峰對稱、激發(fā)光譜分布連續(xù)、熒光發(fā)射波長可控等特點，這些是一般熒光探針材料不具備的。因此，量子點已經(jīng)被廣泛的作為熒光探針工具。本文主要研究氨基化量子點與羧基化量子點在不同的pH值（pH=2.2、7.4、9.0）與不同溫度（27℃、37℃、47℃）環(huán)境下與牛血清白蛋白的相互作用機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】牛血清白蛋白；氨基化量子點；羧基化量子點；光譜分析

量子點與牛血清白蛋白的相互作用一直是國內(nèi)外的研究焦點，但是對量子點與牛血清白蛋白相互作用的報道甚少，有待進(jìn)一步研究。本文主要利用熒光法研究量子點同牛血清白蛋白間的相互作用，測得牛血清白蛋白與氨基化量子點和羧基化量子點相互作用的熒光光譜，然后根據(jù)結(jié)果分析得到兩種量子點在不同pH值和不同溫度環(huán)境下相互間發(fā)生反應(yīng)的熒光猝滅類型（動態(tài)淬滅或者靜態(tài)淬滅）、結(jié)合位點數(shù)n、結(jié)合常數(shù)K及作用力類型（范德華力、疏水作用力、靜電作用力和氫鍵）、用同步熒光法判定白蛋白的構(gòu)象變化情況等。再根據(jù)這些結(jié)果深入了解它們在提取、制備、應(yīng)用和保存方面的要求。

一、熒光淬滅機(jī)理

量子點與牛血清白蛋白的相互作用導(dǎo)致的熒光猝滅類型按照Stern-Volmer方程計算，可以把淬滅類型分為動態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅。這兩種淬滅類型有不同的作用，動態(tài)猝滅不會導(dǎo)致白蛋白的生理活性與其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因為它只是一種能量或者轉(zhuǎn)移電子轉(zhuǎn)移的過程；靜態(tài)猝滅則會影響蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，而且其生理活性也有可能受影響。因為反應(yīng)過程中產(chǎn)生了配合反應(yīng)，并生成不發(fā)熒光的配合物。熒光猝滅類型判定方法可以總結(jié)為：通過熒光隨溫度的變化情況以及熒光壽命進(jìn)行判斷，對于動態(tài)猝滅，高溫會導(dǎo)致體系中的分子運動速度變快，碰撞增加，從而使得動態(tài)猝滅常數(shù)增大；對于靜態(tài)猝滅，較高的溫度會使得配合物分解，使靜態(tài)猝滅常數(shù)降低。熒光猝滅數(shù)據(jù)繪制為量子點濃度與牛血清白蛋白的相對熒光強(qiáng)度間的關(guān)系，量子點導(dǎo)致的牛血清白蛋白的熒光強(qiáng)度猝滅可以由知名Stern-Volmer方程描述：

二、主要儀器、設(shè)備和試劑

1.主要儀器和設(shè)備

1）微量移液器；2）電子天平，杭州衡準(zhǔn)檢測儀器有限公司；3）F-4600熒光分光光度計，日立；4）電腦一臺（含測熒光強(qiáng)度軟件）；5）50mL、100mL、500mL容量瓶若干，5mL試劑瓶若干、50ml、100ml、200ml定容器若干，棉簽若干；6）4ml石英比色皿1個；7）冰箱一臺；8）集熱式恒溫水浴加熱器。

2.主要試劑

1）羧基化量子點，氨基化量子點，通過商業(yè)途徑獲得；2）牛血清白蛋白（BSA），MW：66KDa；3）三羥甲基氨基甲烷（Tris），AR，阿拉丁公司；4）甘氨酸，AR，成都市科龍化工試劑廠；5）濃鹽酸（濃度36%），無水乙醇（AR），重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；6）實驗中用水均為二次去離子水。

三、量子點與牛血清白蛋白反應(yīng)的實驗步驟

準(zhǔn)備10支比色皿，各取3ml 牛血清白蛋白溶液加入10支比色皿中，然后依次加入0～900μL的量子點，最后用pH緩沖液定容為4ml。利用集熱式恒溫加熱水浴加熱之后利用熒光分光光度計以波長365nm的激發(fā)波長測量其熒光光譜。實驗時要求的牛血清白蛋白濃度為1.0×10mol/L，所以分別用不同pH值的緩沖液稀釋濃度為2×10mol/L的牛血清白蛋白，將牛血清白蛋白溶液稀釋50倍，即1ml定容成50ml。取10個容量為5ml的小試管放在試管架中，利用容積可調(diào)的微量移液計往十個小試管中加入3ml的濃度為1.0×10mol/L的牛血清白蛋白溶液，再加入不等量的量子點（從0到1ml，步長為100μl），然后就可以加入與稀釋時相對應(yīng)pH值的緩沖液進(jìn)行定容至4ml。為了能夠檢測出量子點對牛血清白蛋白的熒光程度是否有影響，檢測量子點與牛血清白蛋白是否發(fā)生了反應(yīng)或者相互作用，第一組試管中溶液為純牛血清白蛋白溶液，是以對照組的身份出現(xiàn)的。配置完成之后，打開集熱式恒溫水浴加熱器，將溫度調(diào)節(jié)為27℃，當(dāng)溫度達(dá)到27℃時將帶有10個小試管的試管架放入（注意不可直接將小試管放入）。在集熱式恒溫水浴加熱器中加熱60分鐘，加熱后取出搖晃一段時間使之充分搖勻，之后利用F-4600熒光分光光度計在激發(fā)波長ex=365nm的情況下測量量子點和牛血清白蛋白的熒光光譜圖（pH=9.0與pH=7.4激發(fā)與發(fā)射狹縫都是5nm，pH=2.2激發(fā)與發(fā)射狹縫是10nm）

注意：必須將小試管中的溶液倒入4ml石英比色皿，比色皿必須用無水乙醇來清洗。

四、實驗結(jié)果分析

這個課題運用了熒光光譜法，在分子層次上研究不同的pH值和不同溫度環(huán)境下，氨基化量子點和羧基化量子點與牛血清白蛋白之間的相互作用機(jī)制，得到以下結(jié)論：

1）氨基化量子點與羧基化量子點對牛血清白蛋白的熒光光譜都有淬滅的作用，而且量子點濃度越高，量子點對于牛血清白蛋白的淬滅作用越大。

2）氨基化量子點與羧基化量子點兩種物質(zhì)，分別在三種不同的pH值（pH=2.2、pH=7.4、pH=9.0）和三種不同溫度（27℃、37℃、47℃）環(huán)境下跟牛血清白蛋白相互作用，當(dāng)溫度逐漸升高時，量子點對牛血清白蛋白的淬滅作用逐漸降低，兩種量子點和牛血清白蛋白之間的反應(yīng)是單一的靜態(tài)淬滅類型，反應(yīng)后形成了1：1的配合物。

3）同一pH環(huán)境下，溫度由27℃→37℃→47℃，氨基化量子點與羧基化量子點對牛血清白蛋白的猝滅強(qiáng)度逐漸減弱；在相同溫度環(huán)境， PH值逐漸增加的情況下，氨基化量子點與羧基化量子點對于牛血清白蛋白的淬滅作用逐漸增大。

4） 氨基化量子點與羧基化量子點在不同的pH值和不同溫度環(huán)境下與牛血清白蛋白之間的結(jié)合位點數(shù)接近1，這說明了氨基化量子點與羧基化量子點同牛血清白蛋白具有一個結(jié)合位點，量子點和牛血清白蛋白以1：1的比例從而結(jié)合成一種配合物，所以氨基化量子點與羧基化量子點同牛血清白蛋白間具有相對強(qiáng)的結(jié)合作用力。

5）當(dāng)pH=7.4時，氨基化量子點與羧基化量子點和牛血清白蛋白之間的作用力為靜電作用力和疏水作用力；當(dāng)pH=9.0的時候，氨基化量子點與羧基化量子點間的作用力為范德華力，當(dāng)pH=2.2時，氨基化量子點與羧基化量子點和牛血清白蛋白之間為范德華力與氫鍵。

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