應用固定化α-淀粉酶探究溫度對酶活性的影響

沈唯軍 時 晨 丁 婷

(江蘇省無錫市輔仁高級中學 214123)

“探究溫度對于酶活性的影響”是高中生物學中的探究實驗，人教版教材《分子與細胞》是應用淀粉酶的酶促反應進行實驗。實驗雖簡單易行，但需要耗費較多的酶制品。此外，由于無法回收溶解在淀粉溶液中的酶，學生無法有效地證明“過高溫度會使酶永久失活”的結論。高中生物學選修1教材《生物技術實踐》中“α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測”實驗的酶固定化技術可解決上述問題。本文應用海藻酸鈉固定α-淀粉酶，基于固定化α-淀粉酶技術探究溫度對酶活性的影響，以期實現酶的重復使用，并達到預想的教學效果。

1 實驗原理

(1) 以海藻酸鈉為載體，采用包埋法固定α-淀粉酶： 海藻酸鈉是一種從海藻中提取的親水性膠態多聚糖，在氯化鈣溶液中可以交聯為網狀大分子，從而使淀粉酶被包埋于微膠囊中。在微膠囊內，淀粉酶為大分子物質不能逸出，而酶促反應的底物和產物可自由進出[1,2]。

(2) 淀粉酶活性的測定： 直鏈淀粉經I2-KI溶液染色后會呈現藍色，且在620nm處存在吸收峰。因此，可以采取比色法測定底物淀粉的水解量，以此反映淀粉酶的活性[3]。

2 實驗儀器

試管，電子天平，量筒，玻璃棒，50mL燒杯，支架，分光光度計，滅菌后的注射器，恒溫水浴鍋，酒精燈，pH計等。

3 實驗試劑的配置

(1) 質量分數為2.48%的海藻酸鈉溶液： 用天平稱取0.248g海藻酸鈉，放入50mL燒杯中，加入10mL蒸餾水，用酒精燈小火加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直至完全溶化。

(2) 質量分數為0.5%的淀粉溶液： 稱取0.5g可溶性淀粉，用少量水攪勻后，再加入100mL沸水中，攪拌直至完全溶解，用pH計和稀HCl調節pH至6.0。

(3) 質量分數為5mmol/L I2-KI溶液： 稱取0.127g碘和0.83g碘化鉀，加蒸餾水100mL完全溶解后裝入滴瓶中。

(4) 質量分數為0.23%的游離α-淀粉酶液： 用天平稱取0.23g α-淀粉酶，加蒸餾水100mL溶解。

(5) 質量分數為2.04% CaCl2溶液： 用天平稱取2.04g CaCl2，加蒸餾水100mL溶解。

4 實驗步驟(參見圖1)

4.1 淀粉酶的固定化 參照陳青等[4]采用響應曲面設計法確定的最佳條件，進行淀粉酶的固定化。①將溶解好的海藻酸鈉溶液冷卻至室溫；②向5mL海藻酸鈉溶液中加入5mL游離酶液,并充分攪拌均勻；③用注射器吸取上述混合液,以每秒5滴的速度將注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液中制成凝膠珠，固定0.5h后濾出凝膠珠；④用蒸餾水沖洗凝膠珠2～3次，以洗去其表面的游離酶和氯化鈣,儲存于4℃冰箱中備用。

4.2 在不同溫度條件下，進行酶促反應 ①稱取0.5g固定化酶的凝膠珠，分別置于0℃、25℃、50℃、75℃、100℃中水浴保溫5min；②量取5mL淀粉溶液放入試管中，也分別置于0℃、25℃、50℃、75℃、100℃水浴保溫5min；③把凝膠珠倒入淀粉溶液中，充分混勻，在相應的溫度下反應5min；④取出凝膠珠、中止反應，并用蒸餾水沖洗凝膠珠2～3次，洗去表面的反應液，于4℃冰箱中儲存以備下次使用；⑤把原置于0℃、100℃下的凝膠珠重新置于50℃水浴保溫5min，再與50℃預熱的淀粉溶液充分混勻，在該溫度下反應5min。

4.3 比色法測定淀粉酶的活性 參照Yoo等人[5]的方法，向5mL反應液加入0.1mL I2-KI溶液，充分搖勻顯色。對于配備有分光光度計的學校，可以進一步定量地測定淀粉酶的活性。以蒸餾水代替固定化酶作為空白對照，在620nm波長下測定顯色液的吸光度值，并求出其與空白對照的吸光度差值△A。定義在50℃下反應測得的△A為100%的酶活，以此計算各溫度條件下酶的相對活性，并使用Excel制作成圖表。

5 實驗結果和討論

如圖2所示，利用海藻酸鈉固定α-淀粉酶可以取得不錯的實驗效果，并且固定化的α-淀粉酶能夠長期保持活性。與游離酶相似，固定化α-淀粉酶在50℃下反應時呈現的顏色不明顯，25℃和75℃下藍色較淺，而0℃和100℃下藍色最深。

圖3是學生利用分光光計定量測定的酶活，并以圖表形式進行數學建模。如圖所示： 固定化α-淀粉酶的最適溫度在50℃左右，當反應溫度由0℃上升至50℃，酶的相對活性不斷上升；但隨著溫度的繼續提高，酶活性又逐步下降。此外，雖然0℃下酶活性很低，但是當再置于合適條件(50℃)下依舊可以恢復活性。而在溫度過高(100℃)時,酶將永久失活，再置于合適條件(50℃)下也無法恢復活性。

圖1 實驗設計的流程圖

圖2 在不同反應溫度下比色法測定淀粉酶的活性

圖3 利用分光光度計定量測定不同反應溫度下固定化淀粉酶的相對活性

6 教學反思

新課標對于實驗的開發一直抱著開放的態度，鼓勵教師和學生大膽地進行實驗創新。因此本研究優化整合了相關的實驗項目，并取得了一定的教學效果。第一，提高實驗設計的可操作性： 浙教版“α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測”需要使用石英砂制作固定酶柱，操作繁復而耗時。相對而言，使用海藻酸鈉固定化淀粉酶，不但可以節省實驗的用時和成本，而且在實踐教學中固定化淀粉酶經重復使用10次后依舊可以保留活性。學生可以充分體會到“固定化酶的可回收性和耐藏性”。第二，增強實驗教學的有效性： 利用“固定化酶易與反應體系分離”的特點,學生可以方便地控制酶促反應的進行，例如通過濾除凝膠珠來終止反應或是隨時轉換α-淀粉酶的反應條件。這更便于學生自主地驗證“高溫對酶空間結構破壞的永久性”，避免單純地依賴教師教條式的講解。第三，提升實驗的可探索性： 大數據時代的到來，學會對科研數據的收集和分析是學生必備的素質。相較于常規的定性實驗，利用分光光度計可以協助學生獲得更精確的數據，以此學習在Excel等軟件的輔助下進行數學建模，拓展了探究實驗的深度和廣度。

(基金項目：江蘇省教育科學規劃領導小組辦公室“十二五”重點課題“‘生物科學探究基地’模型建構與整體推進研究”，No.B-b/2013/02/119；無錫市教育科學“十三五”規劃課題“基于生物專業學科建設的職業生涯教育實踐研究”,No.H/E/2016/004)