遺傳物質的發現過程及其啟示

王 穎

(人民教育出版社生物室 北京 100081)

肺炎鏈球菌是一種革蘭氏陽性菌，能引起人的肺炎和呼吸系統的其他疾病。1881年，美國的喬治·斯滕伯格(George Sternberg)和法國的路易斯·巴斯德(Louis Pasteur)分別分離得到這種細菌，最初它被命名為Pneumococcus。1920年改稱肺炎雙球菌(Diplococcuspneumoniae)。因為它與鏈球菌非常相似，1974年被正式命名為肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)。這種菌對小鼠也具有極大的殺傷力，會導致小鼠死亡。

1 格里菲思實驗

1923年，英國衛生部病理實驗室的弗雷德里克·格里菲思(Frederick Griffith， 1879—1941)發現肺炎鏈球菌的菌落有兩種類型： 一種是光滑的圓頂形，形態較為規則，這種菌有莢膜，能引起小鼠死亡，被稱為光滑型(Smooth，S型)；另一種菌落為顆粒狀、不規則，這種菌無莢膜，是減毒的，不會導致小鼠死亡，被稱為粗糙型(Rough，R型)。格里菲思發現S型菌(以下簡稱S菌)經傳代培養可以轉變為R型菌(以下簡稱R菌)。當時已經發現的肺炎鏈球菌根據莢膜多糖的不同可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等。每種類型的肺炎鏈球菌都有光滑品系S菌和粗糙品系R菌[1]。

格里菲思將不同類型的活的R菌分別與加熱致死的S菌同時注入小鼠體內，觀察小鼠的存活，并從小鼠體內分離和鑒定肺炎鏈球菌。在他的一組實驗中，將活的Ⅰ型R菌和加熱致死的Ⅱ型S菌同時注入小鼠體內，幾天后小鼠死亡，從小鼠體內分離出活的Ⅱ型S菌。這種轉化不僅是同型的R菌轉化為S菌，還有Ⅰ型轉化為Ⅱ型[2]。

是什么原因導致Ⅰ型的R菌轉化為Ⅱ型的S菌呢？新產生的Ⅱ型S菌的莢膜多糖來自哪里？格里菲思于1928年發表論文介紹了上述實驗并作出解釋： 死亡的小鼠體內(受體細胞)保留了合成Ⅱ型S菌莢膜多糖的物質，它能夠促使Ⅰ型R型活細菌轉化為Ⅱ型S型活細菌[2]。格里菲思沒有意識到，將R菌轉化為S菌的是加熱致死的S菌中的活性物質，即后人所說的“轉化因子”，他沒有繼續探索遺傳物質的本質。后來，格里菲思不幸死于1941年德國對倫敦發動的一場轟炸中[3]。

2 艾弗里及其合作者的實驗

在格里菲思發表論文兩年后的1930年，美國洛克菲勒研究所奧斯瓦爾德·艾弗里(Oswald Avery， 1877—1955)實驗室的亨利·道森(Henry Dawson)和理查德·夏(Richard Sia)實現了肺炎鏈球菌的離體轉化實驗。他們在含有抗R血清和加熱致死的S菌的液體培養基中培養R菌，結果產生了活的S菌[4]。后來，艾弗里實驗室的詹姆斯·阿洛韋(James Alloway)將S菌過濾，除去一些細胞組分，得到一種無細胞的提取液，并用提取液進行體外轉化實驗獲得成功[5]。1934年，科林·麥克勞德(Colin MacLeod， 1909—1972)加入了艾弗里實驗室，他同艾弗里一起用阿洛韋的體外系統進行轉化實驗。1941年，他們已經很有信心地認為轉化因子是“胸腺類的核酸”[1]。1943年3月，艾弗里首先在洛克菲勒理事會上介紹了他們的實驗過程和結果，并于1944年發表了這個經典的實驗。

他們將S菌用去氧膽酸鹽溶液漂洗數次，用乙醇沉淀，得到黏性的乳白色沉淀。將沉淀溶于鹽溶液，然后用氯仿抽提2～3次除去蛋白，再用乙醇沉淀。將沉淀溶于鹽溶液，加入能夠水解多糖的酶，37℃消化4～6 h后鑒定溶液中的多糖已除去。再用氯仿抽提1次除去水解糖的酶和殘留蛋白，然后用乙醇沉淀。他們就這樣從75 L培養物中得到10～25 mg沉淀，然后將沉淀溶于鹽溶液制成細胞提取物。他們首先用Ⅲ型S菌的細胞提取物與活的Ⅱ型R菌混合進行轉化實驗，并獲得成功。接著，將細胞提取物用不同的酶進行處理后，再與活的Ⅱ型R菌混合進行轉化。具體分這樣幾組： ①細胞提取物用蛋白酶處理，結果能夠轉化；②細胞提取物用RNA酶處理，能夠轉化；③細胞提取物用DNA酶處理，不能轉化；④細胞提取物用脂酶處理，能夠轉化[6]。只有DNA酶能夠阻止轉化實驗，這表明被DNA酶消化分解的DNA極可能就是細胞提取物中有活性的“轉化因子”。接下來，他們分析了“轉化因子”的理化特征： 轉化因子的分子量很大，分子氮磷比約為1.67，在260nm的紫外線照射時具有最大的吸收峰值，檢測DNA的二苯胺反應結果呈強陽性，檢測RNA的苔黑酚檢測結果是弱陽性，兩種檢測蛋白質的方法結果都是陰性，等等。這些理化特征或測試反應的結果都與DNA的極為相似。

艾弗里在論文的結尾處寫道：“本文提出的證據支持以下觀點： 脫氧核糖類型的核酸是肺炎鏈球菌Ⅲ型轉化因子的基本單位。”艾弗里根據這些實驗證據得出上述結論已經有足夠的說服力，但是當時科學界普遍認為蛋白質才是遺傳物質，因此艾弗里在論文中也曾十分謹慎地說：“當然也有可能，這種物質的生物學活性并不是核酸的一種遺傳特性，而是由于某些微量的其他物質所造成的，這些微量物質或者吸附在它上面，或者與它密切結合在一起，因此檢測不出來[6]。”

3 艾弗里的結論引發質疑

艾弗里的論文一經發表就引發質疑，質疑點主要是： 轉化因子究竟是DNA還是和DNA混在一起的少量蛋白質。這些質疑既與“細胞提取物不夠純”的實際情況有關，還與當時科學界對DNA和蛋白質已形成的共識密不可分。

20世紀初，科學家已經知道核酸是由許多核苷酸單元聚合而成的化合物。德國生化學家卡爾·科賽爾(Karl Kossel， 1853—1927)發現核酸由堿基、磷酸和糖組成，并探明了組成核苷酸的四種堿基。1909年，美國生化學家費伯斯·列文(Phoebus Levene， 1869—1940)提出了核苷酸的概念、核苷酸是核酸的基本組成單位。他明確將核酸細分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)，并提出四核苷酸假說： 四個互不相同的核苷酸連接構成四核苷酸，四核苷酸連接組成DNA分子。這個假說認為DNA鏈是單調重復的分子[7]。這可能是因為列文在分析DNA結構時采用了劇烈的提取方法，破壞了DNA的結構，導致他將DNA視作分子量很小(1500 D)的分子[8]。當時“四核苷酸假說”深入人心，并促進了蛋白質的研究。進入20世紀，12種基本氨基酸已被發現，到1940年，其他8種基本氨基酸也一一被揭示。很多科學家認為以20種氨基酸為基本單位的蛋白質似乎含有無數復雜且不重復的遺傳信息。而艾弗里實驗中的細胞提取物含有微量的蛋白質，因此，他們就不接受艾弗里的實驗結論。

持懷疑態度的還有“噬菌體小組”的多位成員。該小組的核心人物是馬克斯·德爾布呂克(Max Delbrück， 1906—1981)、薩爾瓦多·盧里亞(Salvador Luria， 1912—1991)和阿爾弗雷德·赫爾希(Alfred Hershey， 1908—1997)[9]。許多取得杰出成就的科學家都出自這個小組，如詹姆斯·沃森(James Watson， 1928— )、馬修·梅塞爾森(Matthew Meselson， 1930— )、富蘭克林·斯塔爾(Franklin Stahl， 1929— )等。當時，德爾布呂克和噬菌體小組的大多數成員相信四核苷酸假說，因此并不相信艾弗里的結論。他們認為DNA只是一種單調乏味的大分子，怎么可能是遺傳物質的載體呢？

反對艾弗里的還包括他的同事、核酸研究權威阿爾弗雷德·米爾斯基(Alfred Mirsky， 1900—1974)。米爾斯基嘗試從多種生物材料中提取核酸和蛋白質。1946年，他從Ⅲ型肺炎鏈球菌中提取了核酸和蛋白質，并重復了艾弗里的實驗，但是因為很難獲得不含蛋白質的純DNA，因此選擇質疑艾弗里。1949年，米爾斯基發現同種生物不同細胞中的DNA含量相同，體細胞DNA含量是精子含量的兩倍。這個結論本可以支持DNA是遺傳物質，但他仍然不相信僅靠DNA就會攜帶遺傳信息。

4 更多研究讓人們確信DNA就是遺傳物質

面對爭議，艾弗里的研究團隊細化實驗，進一步加強實驗證據。他們采取的方法有： ①優化提取轉化因子的方法，提高轉化因子的種類、產量和純度，將蛋白質最大污染量降至0.02%；②純化DNA酶，1944年他們在實驗中使用的DNA酶并非純化的DNA酶，1946年，麥卡蒂從牛胰中純化DNA酶，并在轉化實驗中稀釋該DNA酶，致使無法檢測到蛋白水解酶活性[10]。

也有科學家利用其他實驗材料取得了與艾弗里等人相同的結果。1945年11月，法國的安德烈·博伊文(André Boivin)宣布： 他成功地實現了大腸桿菌的轉化。他們用從S2型的S菌(大腸桿菌)提取到的核酸去培養S3型的R菌，結果獲得了S2型的S菌。而且，他們也能使S3型轉化為S1型[1]。

其他科學家的發現則徹底否定了四核苷酸假說。首先，1934年卡斯珀森(Torbj?rn Caspersson)用過濾的方法得到核酸，他推測核酸是比蛋白質還要大的大分子。1938年，卡斯珀森與席格納(Rudolf Signer)合作得到了分子量為50萬、100萬道爾頓的DNA分子。這就排除了“DNA是一個小分子”的反對意見。其次，美國生化學家埃爾文·查哥夫(Erwin Chargaff， 1905—2002)發現： 不同生物DNA中四種堿基的比例并不一致，但是腺嘌呤(A)總是與胸腺嘧啶(T)含量一致，鳥嘌呤(G)總是與胞嘧啶(C)一致[11]。這個發現徹底否定了四核苷酸假說，為人們接受DNA是遺傳物質掃清了障礙。

后來，赫爾希和蔡斯(Martha Chase， 1927—2003)的噬菌體侵染實驗再次證明DNA是遺傳物質。他們發現，在噬菌體感染未被同位素標記的大腸桿菌后，35S的蛋白質外殼留在細菌外面，而32P的DNA則出現在細菌內部。如果讓噬菌體與細胞碎片混合，35S就吸附于細胞的碎片上，溶液中則出現了32P的DNA。接著，他們用32P或35S標記的T2噬菌體分別感染大腸桿菌，經過短時間的溫育，再用攪拌器攪拌(使吸附在細菌上的噬菌體與細菌分離)、離心(讓上清液中析出重量較輕的T2噬菌體顆粒)。離心管的沉淀物中留下被感染的大腸桿菌。離心后，檢查上清液和沉淀物中的放射性物質發現： 用35S標記的一組感染實驗，放射性同位素主要分布在上清液中，子代噬菌體幾乎都不含35S；用32P標記的一組實驗，放射性的同位素主要分布在試管的沉淀物中，約有30%的32P出現在子代噬菌體中[12]。當這個結果公布后，起初質疑艾弗里的噬菌體小組則一下子接受了這個結論。1953年，赫爾希-蔡斯實驗與DNA雙螺旋結構模型同時在冷泉港的學術會議上展示，這也使得前者變得引人注目，科學家自此普遍接受DNA是遺傳物質。

5 正確理解艾弗里實驗的價值，厘清三個重要實驗的關系

作為發現遺傳物質本質的第一人，艾弗里的研究結論長期不被接受。在介紹分子生物學歷史的早期著作中，赫爾希-蔡斯實驗被視為證明DNA是遺傳物質的唯一實驗。事實上，艾弗里是人類第一次用確鑿的實驗證據說明遺傳物質的本質，揭示了DNA的重要性。查哥夫正是知道了艾弗里的研究結論后，才轉而研究DNA。而沃森和克里克正是知道了查哥夫法則，才對搭建的模型進行調整從而解析了DNA雙螺旋結構。因此，艾弗里的卓越貢獻不容忽視。

格里菲思實驗是艾弗里等人探究遺傳物質本質的基礎。格里菲思利用肺炎鏈球菌做轉化實驗，開辟了用細菌研究遺傳的新領域，并取得重要結論。而艾弗里的一系列研究是對格里菲思實驗的延伸，并取得了里程碑式的結論，第一次證明DNA是遺傳物質。赫爾希-蔡斯實驗則是對艾弗里實驗結論的進一步支持，他們利用噬菌體作為研究材料，巧妙設計實驗，顯示出杰出科學家的品質和能力，但是研究的目的追隨了艾弗里。

6 遺傳物質的研究過程反映了科學的本質

科學不僅表現為系統化的知識體系，而且還包含有獨特的科學方法和科學精神[13]。毫無疑問，對遺傳物質的探索就是科學發展的過程，對這段歷史的梳理有助于理解科學的本質。

科學之路充滿了觀點的碰撞和論爭。科學是一種不斷發展和自我矯正的探究過程。從1923年格里菲思開始研究肺炎鏈球菌，歷經近30年，人們才確信DNA是遺傳物質。過程雖然曲折，但人類最終探明了遺傳物質的本質。這充分反映出世界是可以被認知的，科學知識并非絕對真理，而是在不斷的修正中完善的；反映出科學知識所具有的可認識性、開放性、可重復性、累積性等。

科學方法和理性思維在科學發現中具有重要作用。科學知識是科學家基于證據、運用科學方法、經過巧妙的實驗設計和嚴密的邏輯推理獲得的。對遺傳物質的探索，科學家充分運用了多種科學方法，展示出他們的理性思維。首先，科學家都采用了實驗法來獲取事實和證據，實驗方法有： 肺炎鏈球菌的體內轉化實驗體系、體外轉化實驗體系(該體系簡化了實驗過程、為鑒定轉化因子打下基礎)、微生物培養技術、同位素標記技術、噬菌體技術等。而且，以細菌、病毒作為研究模型，充分利用實驗對象材料簡單、生長周期短、方便操作等優點。其次，在實驗設計上，艾弗里從混合物中有選擇地除去一種物質，通過觀察轉化活性，確定這種物質是否起作用，這其實是一種“排除法”。噬菌體侵染實驗則是設法將DNA和蛋白質分開，實際也是“排除法”。由此可見，他們的研究對象不同，實驗方法不同，但基于相似的思維方法，得出了同樣的實驗結論。

呈現了科學家質疑、求真、實證等科學精神。科學注重證據和基于證據的邏輯推理。在遺傳物質的發現過程中，基于重要實驗所得到的結論都充分體現了“證據”的作用。艾弗里等人最初制備的粗提物中含有少量蛋白質污染，但他們一直設法提高粗提物和酶的純度，這也是試圖獲得更可靠的證據。這些都反映出科學家的實證、探索、求真的科學精神。