乳腺浸潤性導管癌組織中血管生成擬態和COX-2表達的相關性研究*

黃小環，周鐵軍，馮曉靈△

(1.重慶三峽醫藥高等?？茖W校 404120；2.西南醫科大學附屬第一醫院病理科，四川瀘州 646000)

乳腺癌是一種常見的危及女性健康的惡性腫瘤，具有高發病率、高復發率等特點。目前臨床上主要采取手術切除、術后放化療、內分泌治療等手段，但現有治療措施仍不能很好控制其發展。惡性腫瘤的快速生長需要血液供應，長久以來一直認為，腫瘤的血管來源于血管發生和血管生成兩方面。直到MANIOTIS等[1]提出血管生成擬態(vasculogenic mimicry,VM)，一種不依賴于血管內皮細胞的全新腫瘤血供模式，不同于經典血管生成，管壁沒有內皮細胞附著，腫瘤細胞排列在管壁外表面，其內可見紅細胞、血漿。VM還存在于胃癌、肝細胞癌等多種惡性腫瘤中[2-3]。環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)已經證實為參與VM形成的重要因素之一，本研究擬通過CD34及過碘酸雪夫反應(PAS)雙重染色證實乳腺浸潤性導管癌中是否存在VM，進一步探討COX-2與乳腺癌VM的關系，從而探討VM表達陽性的乳腺癌是否更具有轉移和侵襲性，預后是否更差，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 110例患者乳腺癌標本為試驗組，來自于西南醫科大學附屬第一醫院病理科2011-2015年手術切除乳腺癌的石蠟塊，患者術前未進行放療或化療，石蠟切片由兩位高年資的病理醫師再次閱片確診為乳腺浸潤性導管癌。患者均為女性，年齡28～79歲，腫瘤直徑2～8 cm；腋窩淋巴結轉移80例，未轉移30例；根據WHO乳腺癌分類標準進行病理分級，其中Ⅰ級(高分化)26例，Ⅱ和Ⅲ級(中、低分化)84例。同時選取30例乳腺良性病變患者(乳腺增生15例、乳腺纖維腺瘤15例)作為對照組。

1.2試劑 COX-2單克隆抗體購于cst公司、CD34單克隆抗體購于santa公司、SP法免疫組織化學試劑盒購于bioss公司、PAS染色試劑盒購于solarbio公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學 取出蠟塊，4 μm厚度連續切片,經二甲苯兩次脫蠟；梯度乙醇置換，流水沖洗；將切片架置于檸檬酸液中，放入高壓鍋中抗原修復；每張切片加入3%過氧化氫，阻斷內源性過氧化物酶活性；滴加一抗、Envision試劑和二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素適當復染，脫水透明封片。用已知陽性片做陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

1.3.2CD34和PAS雙重染色 先進行CD34免疫組織化學染色，顯微鏡下觀察血管內皮細胞著色后，水流沖洗1 min，終止顯色反應；將切片置于0.5%的過碘酸溶液中氧化15 min，蒸餾水沖洗2次，每次3 min，此步驟完成后將切片置于Schiff液中，避光下PAS反應15 min；蒸餾水沖洗3次，每次1 min，流水沖洗3 min；蘇木素淺染細胞核1 min，流水沖洗1 min，分化、返藍，常規脫水、透明，中性樹膠封片。

1.3.3VM結果判定 鏡下可見由CD34染色陰性的腫瘤細胞圍成管道樣結構，部分管腔中可見紅細胞和血漿；PAS染色陽性物質圍成一層基膜樣結構，將腫瘤細胞和紅細胞分開[4]。對照組乳腺組織中未見上述現象。

1.3.4COX-2免疫組織化學染色結果判定 在細胞膜或細胞質發現有棕黃色物質沉著者為陽性，以細胞染色強度和細胞陽性百分率兩者得分相加來進行判定。無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃色為3分；細胞陽性率：≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分。上述兩項相加，0～1分為陰性(-)，2～3分為(+)，4分為(++)，5～6分為(+++)，統計時，2～6分均記為陽性。

A、B：VM在試驗組組織中表達(箭頭示)；C、D：VM在對照組組織中無表達

圖1 VM在乳腺組織的表達(CD34、PAS，×400)

2 結 果

2.1VM在乳腺組織的表達 CD34、PAS雙重染色后可見PAS染色陽性物質圍成一層基膜樣結構，將腫瘤細胞和紅細胞分開，CD34染色管壁細胞則為陰性，提示管壁細胞不屬于內皮細胞。試驗組有28例存在VM，陽性率為25.45%，對照組未發現VM，見圖1。

2.2VM與乳腺癌臨床病理特征的關系 VM陽性表達與患者年齡無關(P>0.05)，與腫瘤大小、病理分級及淋巴結轉移有關(P<0.05)，見表1。

表1 VM和乳腺癌患者臨床病理特征的關系

2.3COX-2在乳腺組織的表達 COX-2在試驗組有71.2%(79/110)的陽性表達率，對照組組織中有20.0%(6/30)的陽性表達率，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

A：COX-2在試驗組組織中表達(箭頭示)；B：COX-2在對照組組織中無表達

圖2 COX-2在乳腺組織的表達(SP，×200)

2.4COX-2與乳腺癌臨床病理特征的關系 COX-2在乳腺癌組織中的陽性表達與患者的年齡和腫瘤大小無關(P>0.05)，與病理分級和淋巴結轉移有關(P<0.05)，見表2。

表2 COX-2與乳腺癌臨床病理特征的關系

2.5VM與COX-2關系 28例乳腺癌VM陽性患者中，COX-2陽性表達28例，陽性率為100.0%；在82例乳腺癌VM表達陰性的患者中有58例COX-2陽性表達，陽性率為70.7%；COX-2在VM陽性患者中的陽性表達率明顯高于VM陰性患者，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

VM局部浸潤、轉移是惡性腫瘤十分重要的生物學特性，也是決定患者預后的重要因素，決定這些生物學特性的基礎之一就是血供，公認的腫瘤血液供應來源于血管生成，直到FOLBERG 等[4]在惡性黑色素瘤中發現了一種全新的血供方式。這種方式的特點為管道內面無血管內皮細胞覆蓋，而是被覆模擬血管生成的腫瘤細胞，通過與細胞外的基質相互作用，與存在的血管聯系起來，從而為惡性腫瘤細胞的生長提供更多的血液來源。近年研究發現，其他腫瘤組織中也有VM存在，如肺癌[5]、子宮頸癌[6]、卵巢癌[7]等。本研究結果顯示，110例乳腺癌組織通過CD34和PAS雙重染色，其中28例證實VM存在，與SHIRAKAWA等[8]研究結果一致。近年關于VM與腫瘤臨床病理特征相關性的研究中，LIU等[9]對肝癌的研究發現VM與腫瘤大小、病理分期、淋巴結轉移有著密切聯系，本研究也發現在乳腺癌中也具有這一特點。

COX-2在正常組織細胞中多不表達或低表達，但在多種上皮來源腫瘤中因環境誘導而出現高表達現象。有關研究表明，COX-2在食管癌等多種腫瘤組織中呈現高表達現象，此現象與腫瘤的發生、發展、浸潤和轉移密切相關[10]。在本研究中，COX-2在乳腺癌組織中的陽性表達率明顯高于乳腺良性病變組織。COX-2與乳腺癌臨床病理特征有關，病理分化越低，COX-2表達反而越高，有淋巴結轉移的乳腺癌組織COX-2陽性表達率高于淋巴結未轉移組，而與患者年齡、腫瘤大小無關。因此，檢測COX-2的表達，可以評估乳腺癌患者的預后，臨床上可抑制COX-2的表達，對分化程度低、發生淋巴結轉移的患者進行臨床干預。

研究表明，COX-2可促進前列腺素E2(PGE2)的表達，PGE2與其受體EP3結合后通過蛋白激酶C(PKC)，激活ERK1/2，調控VM生成[11]。JANA等[12]研究表明，表達COX-2的乳腺癌組織VM表達為陽性，通過抑制COX-2的表達能夠使VM的表達被抑制，說明COX-2是促進VM形成的一個重要因素。本研究顯示，COX-2在VM陽性患者中的陽性表達率明顯高于VM陰性患者，兩者在乳腺癌組織中的表達有相關性，說明在乳腺癌VM形成過程中，COX-2起著重要作用。

本課題組下一步擬通過siRNA技術靶向沉默COX-2基因的表達，應用PCR、Western blot等技術檢測基因沉默后VM的表達，為后續研究干擾VM的形成，阻斷惡性腫瘤生長的血液供應提供新思路，并為惡性腫瘤的基因治療尋找新的方向。