硫化氫對急性百草枯中毒大鼠肺過氧化損傷的影響*

陳文龍,舒 維,湯旭惠,肖翔宇,傅 強,陳寧南,陳運和

( 1.江西省人民醫(yī)院急診科,南昌 330006,2.江西省胸科醫(yī)院呼吸科,南昌 330006)

百草枯(paraquat，PQ)是一種非選擇型除草劑，因其除草效率高，被廣泛應(yīng)用。PQ對人和動物均有強毒性，主要通過口服途徑引起急性中毒，中毒致死率非常高[1]，是目前國內(nèi)中毒致死率最高的農(nóng)藥。PQ進(jìn)入體內(nèi)吸收后，在肺內(nèi)聚集，較大劑量可短時間引起急性肺損傷，多臟器功能障礙，晚期導(dǎo)致肺纖維化，呼吸衰竭[2]。研究認(rèn)為，過氧化損傷為PQ中毒造成機體損傷的重要環(huán)節(jié)。目前PQ中毒治療仍處在探索期，尚未發(fā)現(xiàn)特效解毒劑，也無有效的排毒劑。長期以來，硫化氫(H2S)被認(rèn)為是一種有毒氣體，但近些年被證實是一種新的氣體信號分子[3]。 國內(nèi)外的許多研究已經(jīng)證實，內(nèi)源性H2S參與機體多種生理和病理過程，H2S具有舒張血管、清除氧自由基、抑制炎癥因子,改善再灌注損傷，抑制肺纖維化等作用。本實驗以NaHS作為H2S供體干預(yù)PQ中毒大鼠，探討H2S對PQ中毒大鼠肺過氧化損傷的影響，為改善PQ中毒的治療效果提供理論依據(jù)。

圖1肺組織病理圖(HE×200)

1 材料與方法

1.1動物及分組 選擇30只健康雄性SD大鼠,普通級，體質(zhì)量(350±50)g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗部提供。隨機分為對照組、模型組、治療組，每組10只。

1.2材料 質(zhì)量濃度為20%PQ濃縮液購自上海先正達(dá)有限公司，NaHS注射液購自Sigma-Aldrich公司，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3方法

1.3.1造模方法 模型組：采用PQ(80 mg/kg)一次性灌胃，復(fù)制急性PQ中毒模型[4]；同時腹腔注射生理鹽水(6 mL/kg)，2次/d，連續(xù)3 d。治療組：采用PQ(80 mg/kg)一次性灌胃染毒法染毒后,腹腔注射NaHS(1.4 μmoL/kg)，2次/d[5]。對照組：采用等量生理鹽水灌胃后，腹腔注射生理鹽水(6 mL/kg),2次/d。

1.3.2觀察指標(biāo) 72 h后采用10%水合氯醛(4.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，然后取出肺臟組織，觀察大體情況；分離大鼠肺組織，取大鼠右肺中葉用4 ℃生理鹽水沖洗，用濾紙將水吸干，稱濕質(zhì)量(W)，然后將肺組織置于80 ℃烘干48 h，稱干質(zhì)量(D)，計算肺W/D。取大鼠右肺后葉打漿、離心，硫代巴比妥酸(TBA)法測定肺組織勻漿內(nèi)MDA水平，黃嘌呤氧化酶(羥胺)法測定肺組織勻漿內(nèi)SOD活力，酶促谷胱甘肽反應(yīng)法測定肺組織勻漿內(nèi)GSH-Px活力。取左側(cè)肺組織10%甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

2 結(jié) 果

2.1肺臟的大體情況 對照組大鼠雙肺呈均勻粉色、無充血水腫、未見出血點、光滑，觸之柔軟；模型組大鼠雙肺明顯充血水腫、呈不均一暗紅色、表面見出血點、片狀出血灶、觸之粗糙；治療組雙肺表面呈現(xiàn)充血腫脹、可見少量出血點。

2.2肺組織病理結(jié)果 對照組肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；模型組肺泡水腫充血、肺泡間質(zhì)增厚、肺泡間隙大量炎癥細(xì)胞浸潤和聚集、毛細(xì)血管擴張、充血；治療組肺組織損傷較模型組減輕，見圖1。

2.3肺組織W/D比值 與對照組大鼠肺組織W/D(3.06±0.40)比較，模型組(6.68±0.78)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組肺組織W/D(5.41±0.68)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4肺組織勻漿內(nèi)MDA水平及SOD、GSH-Px活力 模型組中MDA水平明顯高于對照組，SOD、GSH-Px活力明顯低于對照組(P<0.05)；治療組MDA水平較模型組明顯降低，SOD、GSH-Px活力較模型組明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠肺組織勻漿MDA水平及SOD、GSH-Px活力變化

a：P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與模型組比較

3 討 論

PQ經(jīng)皮膚、胃腸道及呼吸道等吸收后，分布于肺臟、肝臟、腎臟、骨骼肌等臟器組織中，在肺組織的濃度最高。PQ在肺組織內(nèi)的聚集作用，依賴于肺泡Ⅱ型細(xì)胞、肺泡Ⅰ型細(xì)胞及氣管Clara細(xì)胞的細(xì)胞膜上胺類攝取系統(tǒng)，PQ通過與胺類物質(zhì)競爭而被主動攝入，在肺組織內(nèi)聚集[6]。PQ進(jìn)入機體組織后，經(jīng)還原型輔酶Ⅱ還原作用生成氧自由基(PQ+)，然后與氧分子(O2)形成二聯(lián)吡啶陽離子及超氧陰離子(O2-)。O2-在SOD作用下歧化形成過氧化氫(H2O2)，H2O2經(jīng)Fe2+作用產(chǎn)生毒性更強的氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能破壞[7]。過氧化反應(yīng)還能促進(jìn)中性粒細(xì)胞的炎性浸潤、影響細(xì)胞凋亡[8]。MDA是氧化應(yīng)激的重要代謝產(chǎn)物，其組織濃度體現(xiàn)了組織細(xì)胞過氧化損傷的嚴(yán)重程度[9]。SOD是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，它能清除體內(nèi)多種有毒性作用的氧自由基，消除氧自由基對細(xì)胞膜生物功能蛋白及DNA的破壞，具有抗氧化、抗毒性作用，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。本實驗也證實，PQ中毒后，肺組織出現(xiàn)過氧化損傷，MDA水平顯著升高，SOD、GSH-Px活力顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用抗氧化劑治療百草枯中毒，可以阻斷炎性細(xì)胞與自由基之間的惡性循環(huán)，降低組織中MDA的水平，減輕肺組織的過氧化損傷，改善肺泡功能，抑制肺纖維化[10-11]。

H2S是繼NO、CO之后被發(fā)現(xiàn)的第3種重要的內(nèi)源性氣體信號介質(zhì)，廣泛參與機體多系統(tǒng)病理生理功能調(diào)節(jié)，能夠影響炎癥因子、血管增生、細(xì)胞凋亡，對多臟器的缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，H2S具有抑制氧自由基，抗氧化損傷作用。H2S通過直接清除氧自由基、抑制氧自由基的生成、促進(jìn)機體抗氧化作用等調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激[12]。何艷晶等[13]應(yīng)用外源性H2S干預(yù)大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型，發(fā)現(xiàn)H2S在COPD大鼠中有抗氧化作用。王勇等[14]實驗發(fā)現(xiàn)，外源性H2S通過抑制氧自由基對脂多糖致大鼠急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。本實驗采用NaHS溶液作為外源性H2S供體簡單易行。H2S在體內(nèi)以未分解的H2S、HS-和H+的形式存在，維持動態(tài)平衡。NaHS溶液同樣以H2S、HS-、H+和Na+的方式存在，與飽和H2S溶液比較，NaHS溶液定量更準(zhǔn)確。

本研究結(jié)果顯示，模型組與對照組大鼠比較，肺組織勻漿MDA水平明顯升高，SOD、GSH-Px活力降低，肺組織W/D明顯增高，肺肉眼觀察充血、水腫、出血明顯，光鏡下肺組織明顯損傷，符合PQ中毒急性肺損傷表現(xiàn)，證實采用PQ(80 mg/kg)灌胃染毒能成功復(fù)制急性PQ中毒大鼠肺過氧化損傷模型。治療組大鼠與模型組比較，MDA水平降低，SOD、GSH-Px活力升高，雙肺充血、水腫、出血減輕，光鏡下肺組織損傷明顯減輕。據(jù)以上結(jié)果分析，H2S能夠抑制急性PQ中毒大鼠肺過氧化損傷，對急性肺損傷具有一定的保護(hù)作用。但是因觀察的時間有限，還需更長時間對肺纖維化的影響、臟器功能影響、中毒預(yù)后，以及不同濃度H2S的作用比較進(jìn)行觀察。