丹參酮ⅡA對髓母細胞瘤的增殖 凋亡及自噬的影響*

項 榮,鄒 劍

(成都市第五人民醫院藥劑科 611130)

髓母細胞瘤是兒童最為常見的顱內腫瘤，占兒童顱內腫瘤總數的12%～25%，一般認為髓母細胞瘤起源自原始神經胚胎殘余上皮細胞，惡性程度非常高，為WHO中樞神經系統Ⅳ級腫瘤[1-2]。髓母細胞瘤侵襲、轉移性很強，易通過腦脊液侵襲至軟腦膜，手術切除后易復發，且對放化療不敏感，預后極差，因此尋找治療髓母細胞瘤的新藥物尤為重要[3]。丹參酮ⅡA為中藥丹參的重要活性成分，是由乙醇或乙醚從丹參根中提取出的櫻紅色針狀結晶，臨床主要用于心血管疾病的治療[4]。近年研究發現，丹參酮ⅡA還具有抗腫瘤的功效，其對肺癌、肝癌、白血病、乳腺癌等各類腫瘤細胞均具有毒性作用，能夠抑制癌細胞增殖，促進癌細胞分化、凋亡，抑制癌細胞侵襲、轉移，其作用機制可能與DNA合成被抑制、原癌和凋亡基因表達異常等有關[5-6]。丹參酮ⅡA對髓母細胞瘤細胞增殖和凋亡的作用還少見報道。本研究旨在探究丹參酮ⅡA對人髓母細胞瘤D341細胞增殖、凋亡及自噬的影響，并檢測凋亡與自噬相關蛋白的表達變化，探討丹參酮ⅡA治療髓母細胞瘤的潛在價值，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞株、試劑與儀器 人D341細胞株購自北京協和醫院細胞庫；丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(規格：2 mL∶10 mg，批準文號：國藥準字H31022558)購自上海第一生化藥業有限公司；RPMI-1640培養基、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清均購自美國Gibco公司；Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購自成都艾特姆生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒購自上海歌凡生物科技有限公司；一抗兔抗人雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗體均購自Bioworld生物科技公司；一抗兔抗人微管蛋白1輕鏈3-Ⅰ/Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅰ/Ⅱ，LC3-Ⅰ/Ⅱ)、Beclin1多克隆抗體及二抗辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG均購自美國Santa Cruz公司；透射電子顯微鏡購自日本JEM-1011公司；EPICSXL流式細胞儀購自美國Beckman Couhe公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將適量D341細胞置入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(含100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)中，并在37 ℃、5% CO2、濕度飽和的恒溫箱中培養。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖 將D341細胞用培養基調整為5×107/L，按每孔200 μL細胞懸液接種至96孔板中，培養24 h后加入丹參酮ⅡA，終濃度依次為0、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L，設置6個復孔，以不加丹參酮ⅡA的孔作為空白對照；分別在培養24、48、72 h后，向每孔加入20 μL MTT液[5 mg/mL，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解]，在37 ℃、5% CO2恒溫箱中繼續培養4 h后，小心棄去上清液，向每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，搖床振蕩10 min充分溶解結晶；用酶標分析儀測定450 nm波長處各孔的吸光度(A)值，每組重復測定3次，求取均值。細胞增殖抑制率=(空白對照組A450 nm-給藥組A450 nm)/空白對照組A450 nm×100%。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡 將D341細胞調整為5×107/L，按每孔200 μL懸液接種至96孔板，培養24 h后加入丹參酮ⅡA，終濃度依次為0、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L，設置6個復孔；在培養72 h后，用0.01 mol/L PBS洗滌2遍后，收集細胞；用500 μL結合緩沖液重懸細胞，接著加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后避光孵育15 min；用EPICSXL流式細胞儀采集數據，并用Cell Quest軟件分析凋亡細胞百分率。

1.2.4透射電鏡觀察細胞自噬 將培養的D341細胞分為空白對照組和5.0 mg/L丹參酮ⅡA；在培養72 h后，收集細胞；固定于含2.5%戊二醛、2%多聚甲醛的PBS中2 h以上；0.1 mol/L PBS洗滌；梯度乙醇脫水；丙酮包埋液包埋；先后置于37、45、60 ℃烘箱中固化；以50～60 nm厚度超薄切片；最后在透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.5Western blot檢測細胞mTOR、p-mTOR、VEGF、LC3-Ⅰ/Ⅱ和Beclin1蛋白表達 將D341細胞調整為5×107/L，向96孔板每孔接種200 μL懸液，待細胞貼壁生長后加入丹參酮ⅡA，終濃度依次為0、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L，設置6個復孔；在培養72 h后，向對應孔加入適量PMSF裂解液，常規提取細胞蛋白，用BCA法定量蛋白并調好濃度。每組取50 μg蛋白樣品與上樣緩沖液混合，沸水浴使蛋白變性；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳；轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，置于含5%脫脂奶粉TBST溶液避光封閉1 h；TBST漂洗后，將膜置于一抗稀釋液(mTOR、p-mTOR、VEGF均為1∶100，LC3-Ⅰ/Ⅱ為1∶150，Beclin1為1∶1 000)中，4 ℃孵育過夜；次日早晨TBST漂洗后，置于二抗稀釋液(1∶5 000)中，搖床室溫孵育1 h；TBST漂洗后，發光液均勻加于膜上，5 min后吸去多余溶液，置于暗盒中曝光、顯影、定影。使用GIS-2020系統掃描并分析蛋白雜交條帶。以β-actin為內參蛋白。

2 結 果

2.1丹參酮ⅡA對D341細胞增殖的影響 MTT結果顯示，隨著給藥濃度的增加，丹參酮ⅡA對D341存活的抑制作用不斷增強，差異有統計學意義(P<0.05)；同一丹參酮ⅡA濃度下，隨著作用時間延長，D341細胞增殖抑制率亦逐漸降低，見表1。

2.2丹參酮ⅡA對D341細胞凋亡的影響 流式細胞儀結果顯示，丹參酮ⅡA可顯著誘導D341細胞凋亡(P<0.05)，隨著給藥濃度的增加，D341細胞凋亡率不斷增加(P<0.05)，見圖1。

A:0 mg/L丹參酮ⅡA;B:0.5 mg/L丹參酮ⅡA;C:1.0 mg/L丹參酮ⅡA;D:2.0 mg/L丹參酮ⅡA;E:5.0 mg/L丹參酮ⅡA

圖1丹參酮ⅡA處理D341細胞72 h時流式細胞儀檢測結果

表1 不同濃度丹參酮ⅡA對D341細胞存活率的影響

a：P<0.05，與丹參酮ⅡA 0 mg/L比較

2.3丹參酮ⅡA對D341細胞自噬的影響 透射電鏡結果顯示，對照組D341細胞膜完整，染色質呈均勻分布；5.0 mg/L丹參酮ⅡA處理72 h時發現，細胞核染色質濃縮、邊緣化，一些細胞明顯裂解，細胞質中可見空泡結構，見圖2。

A:0 mg/L丹參酮ⅡA;B:5.0 mg/L丹參酮ⅡA

圖2丹參酮ⅡA處理D341細胞72 h時透射電鏡檢測結果

2.4丹參酮ⅡA對D341細胞mTOR、p-mTOR、VEGF表達的影響 Western blot結果顯示，隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，D341細胞中mTOR蛋白表達水平變化不明顯(P>0.05)，p-mTOR和VEGF蛋白表達水平逐漸降低(P<0.05)，見圖3、表2。

圖3 丹參酮ⅡA對D341細胞中mTOR、p-mTOR、VEGF表達的影響

表2 D341細胞中mTOR、p-mTOR、VEGF蛋白相對表達灰度值

a：P<0.05，與丹參酮ⅡA 0 mg/L比較；以β-actin作為內參基因

圖4 丹參酮ⅡA對D341細胞中自噬相關蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ表達的影響

2.5丹參酮ⅡA對D341細胞LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin1表達的影響 Western blot結果顯示，隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，D341細胞中LC3-Ⅰ蛋白表達水平逐漸降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ蛋白表達水平逐漸升高(P<0.05)，Beclin1蛋白表達水平逐漸升高(P<0.05)。見圖4、表3。

表3 D341細胞中LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin1蛋白相對表達灰度值

a：P<0.05，與丹參酮ⅡA 0 mg/L比較；以β-actin作為內參基因

3 討 論

丹參酮ⅡA是從中藥丹參中提取出的脂溶性物質，可抵抗多類腫瘤細胞，近年該藥物的抗癌機制研究成為基礎醫學領域的研究熱點。丹參酮ⅡA能夠從多方面發揮抑瘤作用：阻滯腫瘤細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖、轉移、侵襲，誘導腫瘤細胞分化、凋亡，降低腫瘤細胞黏性，以及誘導腫瘤細胞自噬，但其具體調控機制還需深入研究[7-9]。

本研究結果顯示，隨著給藥濃度的增加，丹參酮ⅡA對D341細胞增殖、凋亡的抑制作用不斷增強，而且同一濃度下，隨著時間延長，D341細胞增殖、凋亡抑制率亦逐漸增加，說明丹參酮ⅡA可抑制D341細胞增殖、誘導D341細胞凋亡。mTOR是最初從酵母中發現的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，隨后發現其在哺乳動物中也廣泛存在，有助于細胞檢測周圍營養物質而調控細胞的增殖、生長和代謝。在人體內，mTOR作為分子傳感器，使細胞對正常或極端的內環境做出正確應答[10-12]。有關研究發現，mTOR信號通路主要調控細胞周期G1期相關蛋白的合成，與多類惡性腫瘤的生長、增殖、分化、凋亡等關系密切，起著重要的調控作用，mTOR被過度磷酸化激活后可導致癌癥發生，故抑制mTOR通路能阻滯細胞周期進展，從而促進細胞凋亡[13-14]。本研究Western blot結果顯示，隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，D341細胞中mTOR蛋白表達水平變化不明顯，mTOR蛋白的磷酸化水平逐漸降低，說明丹參酮ⅡA對mTOR蛋白表達無明顯作用，但可抑制mTOR蛋白的磷酸化。腫瘤血管不斷新生是腫瘤生長、遷移的關鍵，VEGF為很常見的血管生長促進因子[15-16]。本研究發現，隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，D341細胞中VEGF蛋白表達水平逐漸降低，說明丹參酮ⅡA可能通過抑制VEGF相關通路而促進D341細胞凋亡。

自噬能消化構型異常的蛋白質、多余或受損的細胞器為細胞提供養分與能量，是真核細胞特有的保護機制[17]。大量研究表明，自噬與腫瘤、感染、神經退化、炎癥等疾病的發生、發展過程有關[18]。本研究透射電鏡結果顯示，對照組D341細胞膜完整，染色質呈均勻分布；5.0 mg/L丹參酮ⅡA處理72 h時發現，細胞核染色質濃縮、邊緣化，一些細胞明顯裂解，說明丹參酮ⅡA可促進D341細胞自噬。自噬相關蛋白LC3在進化過程中高度保守，為自噬體產生的標志，可特定地反映出胞內自噬體的多少。LC3包括Ⅰ型與Ⅱ型，LC3-Ⅰ定位在細胞質內，其可與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ定位在自噬體膜的表面，參與自噬體的形成，常被用于衡量細胞自噬的程度[19]。Beclin1是首先被發現促進腫瘤細胞自噬的因子，在各類惡性腫瘤中Beclin1蛋白表達較正常組織下調，其雜合子的異常缺失也可能為腫瘤惡化的一個重要原因[20-21]。Western blot結果顯示，隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，D341細胞中LC3-Ⅰ蛋白表達水平逐漸降低，LC3-Ⅱ蛋白表達水平逐漸升高，Beclin1蛋白表達水平逐漸升高，說明丹參酮ⅡA可能通過上調LC3-Ⅱ、Beclin1表達和下調LC3-Ⅰ表達來促進D341細胞自噬。

綜上所述，本研究發現丹參酮ⅡA可抑制髓母細胞瘤D341細胞增殖，誘導D341細胞凋亡，促進D341細胞自噬，且可能與p-mTOR、VEGF、LC3-Ⅰ表達下調及LC3-Ⅱ、Beclin1表達上調有關。然而腫瘤發生、發展的相關影響因素很多，機制復雜，丹參酮ⅡA對D341細胞的抑制作用還需繼續深入地探究。