原發(fā)性肝癌患者癌旁組織中GP73、GPC3蛋白表達(dá)及意義

金濤，何前進(jìn)，毛偉明，張喜華，岑紅兵

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢430077；2黃岡市中心醫(yī)院)

肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均位居世界首位[1]。目前肝癌的治療主張手術(shù)為主的綜合治療。近年來(lái)，盡管肝臟外科有了長(zhǎng)足發(fā)展，但肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率仍較高。如果能提前預(yù)測(cè)和較早地發(fā)現(xiàn)、處理肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移灶，可延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，部分患者還可能因此徹底治愈[2,3]。目前報(bào)道的肝癌預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)記物很多，但絕大部分都是圍繞肝癌組織進(jìn)行的。近年研究發(fā)現(xiàn)，癌旁組織在肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中也起著決定性的作用[4]。高爾基體蛋白73(GP73)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是繼AFP之后發(fā)現(xiàn)的新的肝癌血清診斷標(biāo)志物，除了能診斷肝癌外，二者在肝癌組織中的表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)[5～9]。而GP73和GPC3在癌旁組織中的表達(dá)是否也能用于判斷肝癌患者的預(yù)后目前少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者癌旁組織中GP73、GPC3蛋白的表達(dá)情況，探討二者對(duì)肝癌切除術(shù)后患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2008～2015年在湖北省黃岡市中心醫(yī)院接受肝癌根治術(shù)的原發(fā)性肝癌患者106例，男89例、女17例，年齡28～72歲、平均48.9歲。均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診。患者HBsAg均陽(yáng)性，HCV、HIV抗體均陰性，術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療、靶向治療和免疫治療。收集患者術(shù)后的癌旁組織(距離肝癌組織大于2 cm)。另選擇10例肝血管瘤患者，HBsAg、HCV、HIV均陰性，取距血管瘤3 cm以上的正常肝組織。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 癌旁組織和正常肝組織中GP73、GPC3蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化染色法。將收集的癌旁組織和正常肝組織用石蠟包埋，切片，脫蠟至水，PBS清洗。加入3% H2O2溶液中室溫孵育15 min，PBS洗滌。將切片置入pH 9.0的緩沖液中，微波抗原修復(fù)。滴加封閉液(10%的山羊血清)，室溫靜置2 h。棄封閉液，滴加一抗(GP73單克隆抗體1∶300的稀釋，GPC3單克隆抗體1∶250的稀釋)，4 ℃過(guò)夜。滴加生物素化的二抗，37 ℃孵育15 min，PBS洗滌。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素室溫孵育15 min，PBS洗滌。DAB顯色，自來(lái)水中止反應(yīng)。采用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。GP73和GPC3的陽(yáng)性細(xì)胞百分比<1%為0分，1%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分；細(xì)胞染色棕褐色為3分，棕黃色為2分，黃色為1，無(wú)色為0分。兩者相加0～1分為陰性，≥2分為陽(yáng)性；2～3分為低表達(dá)，≥4分為高表達(dá)。

1.3 患者隨訪方法 患者術(shù)后每3個(gè)月復(fù)查1次，隨訪至2018年2月，記錄患者總生存期(OS)和無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，判斷相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)法；非正態(tài)分布資料比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法分析患者生存情況。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌旁組織中GP73和GPC3蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況 癌旁組織中GP73蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為48.1%(51/106)，GPC3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為32.1%(34/106)，二者均以胞質(zhì)染色為主。正常肝組織中GP73和GPC3蛋白均為陰性表達(dá)，與癌旁組織相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。

2.2 不同臨床病理特征患者癌旁組織中GP73和GPC3表達(dá)比較 見(jiàn)表1。合并肝硬化和血管侵犯患者癌旁組織中GP73蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于未合并肝硬化和血管侵犯患者，合并血管侵犯患者癌旁組織中GPC3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于未合并血管侵犯患者(P均<0.05)。

表1 不同臨床病理特征的肝癌患者癌旁組織中GP73和GPC3表達(dá)比較(例)

2.3 癌旁組織中GP73、GPC3表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier生存分析顯示，癌旁組織GP73和GPC3蛋白陽(yáng)性表達(dá)的患者預(yù)后較差(P<0.05)。其中GP73高表達(dá)和低表達(dá)患者OS分別為(27.5±3.7)、(53.6±4.1)個(gè)月(P=0.000)；PFS分別為(20.9±4.3)、(44.2±6.9)個(gè)月(P=0.012)。GPC3高表達(dá)和低表達(dá)患者OS分別為(34.7±5.2)、(48.5±4.8)個(gè)月(P=0.010)；PFS分別為(25.7±6.4)、(40.1±5.5)個(gè)月(P=0.001)。COX單因素和多因素回歸分析顯示，肝癌癌旁組織中GP73 和GPC3高表達(dá)是肝癌術(shù)后OS和PFS不良的獨(dú)立預(yù)后因素(P均<0.05)。

3 討論

肝癌是一個(gè)較易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移除了同肝癌細(xì)胞自身的惡性程度及生物學(xué)行為密切相關(guān)外，還與腫瘤生長(zhǎng)的土壤即癌旁微環(huán)境密切相關(guān)[4]。文獻(xiàn)[5，6]報(bào)道顯示，肝癌癌旁組織中PD-L1、EpCAM等蛋白的高表達(dá)與肝癌的預(yù)后不良密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌癌旁組織中GP73和GPC3蛋白表達(dá)也與患者的預(yù)后密切相關(guān)。

GP73是一種整合膜蛋白。疾病狀態(tài)下，GP73可從高爾基體順面膜囊上釋放到胞質(zhì)，胞質(zhì)中被蛋白轉(zhuǎn)化酶酶切，然后通過(guò)內(nèi)涵體運(yùn)輸，釋放到胞外，進(jìn)入血液。研究發(fā)現(xiàn)，GP73的表達(dá)和肝臟疾病關(guān)系密切，正常肝組織中大部分肝細(xì)胞不表達(dá)GP73，僅有少量的肝細(xì)胞低表達(dá)GP73，而GP73在肝炎、肝硬化組織中表達(dá)卻明顯增高，在肝癌組織中表達(dá)最高[7]。文獻(xiàn)[8，9]報(bào)道，肝癌組織中GP73高表達(dá)的患者預(yù)后較差，生存時(shí)間較短。本研究發(fā)現(xiàn)，GP73在10例正常肝組織中均為陰性表達(dá)，這與既往的文獻(xiàn)[8～12]報(bào)道相一致。而GP73在48.1%癌旁組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，這可能與癌旁組織通常為肝炎或肝硬化組織有關(guān)。癌旁組織中GP73蛋白高表達(dá)的患者預(yù)后較差，并且癌旁組織中GP73蛋白表達(dá)與肝硬化及血管侵犯密切相關(guān)，在肝硬化的癌旁組織中的表達(dá)高于非肝硬化的癌旁組織,同時(shí)癌旁高表達(dá)GP73的患者較易出現(xiàn)腫瘤組織的血管侵犯。

GPC3在胎盤(pán)、胚胎肝、胚胎肺和胚胎腎中均有表達(dá)，但在成人的正常肝、肺、腎中均無(wú)表達(dá)。它的Arg(358)和Ser(359)間分裂產(chǎn)生可溶性GPC3，在肝癌患者血清中特異性升高，可作為肝癌的診斷標(biāo)記物[13]。在一段時(shí)間內(nèi)，GPC3一直被作為肝癌的血清標(biāo)記物加以研究，最近的研究發(fā)現(xiàn)，GPC3同肝癌的預(yù)后密切相關(guān)，GPC3高表達(dá)的患者預(yù)后較差[10～12]。有研究顯示，GPC3可通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。針對(duì)GPC3的多肽疫苗還可抑制肝癌患者腫瘤的生長(zhǎng)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，GPC3在被檢測(cè)的正常肝組織中均為陰性表達(dá)，而在32.1%的癌旁組織中呈陽(yáng)性表達(dá)。癌旁組織中GPC3的表達(dá)對(duì)患者的預(yù)后也有預(yù)測(cè)價(jià)值，GPC3高表達(dá)患者無(wú)論是OS還是DFS均明顯差于GPC3低表達(dá)的患者，并且GPC3可作為預(yù)測(cè)肝癌患者術(shù)后OS和DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，肝癌術(shù)后應(yīng)同時(shí)對(duì)腫瘤組織和癌旁組織進(jìn)行相關(guān)基因的檢測(cè)，對(duì)較易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者，如癌旁組織中GP73和GPC3過(guò)表達(dá)者，應(yīng)密切隨訪和積極干預(yù)，從而鞏固手術(shù)療效，延長(zhǎng)肝癌患者的生存時(shí)間。