雷公藤多苷治療對中重度類風濕關節(jié)炎患者外周血單個核細胞miR-146a表達的影響

張英，韓俊

(江漢大學附屬醫(yī)院，武漢430015)

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種自身免疫性疾病，以慢性進展的關節(jié)滑膜炎癥為特征。它主要引起關節(jié)疼痛和腫脹，若未積極治療，將最終導致關節(jié)畸形和殘疾并嚴重影響患者生活質量[1]。雷公藤多苷(TwHF)是一種傳統中藥，其可通過抑制炎性細胞和炎性因子的產生，從而緩解RA病情。微小RNA(miRNA)是一種內源性單鏈小分子RNA。通過與mRNA結合抑制翻譯或造成mRNA被酶解、切割而起到基因調控的作用[2]。有研究表明，miR-146a在RA和其他自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[3，4]。但miR-146a在TwHF治療RA中的作用尚不清楚。本研究通過觀察RA患者應用TwHF治療前后外周血單個核細胞(PBMC)中miR-146a表達的變化，評價miR-146a表達變化與RA患者臨床應答的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2016年12月在我院就診的中重度活動性RA患者62例，男22例、女40例，年齡(45.45±15.91)歲，病程11～27個月。納入標準：符合2010年ACR/EULAR關于RA的分類標準；年齡18～65歲；疾病處在中度至重度活動性，定義為28關節(jié)疾病活動度(DAS28)≥3.2分；經甲氨蝶呤(MTX)或來氟米特(LEF)單藥治療效果不佳。排除標準：患有嚴重關節(jié)變形或接受過關節(jié)手術者；6個月內接受過TwHF、生物制劑或抗風濕病情藥物(DMARDs)聯合治療者；合并肝腎功能嚴重異常、惡性血液疾病或惡性實體腫瘤、嚴重感染者；妊娠或哺乳期婦女；認知功能障礙或難以進行項目評估者；因難以耐受治療或治療無效退出研究者；治療過程中失訪者。另選擇性別、年齡匹配的60例健康志愿者作為對照組，男25例、女35例，年齡(43.72±13.84)歲。本研究獲得本院倫理委員會同意和批準，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 治療方法 RA患者給予TwHF治療，20 mg/次、3次/d，連續(xù)24周。根據患者病情，可聯合MTX或LEF治療。

1.3 療效評價方法 在RA患者接受治療的基線期、12周、24周分別評估DAS28評分，根據治療24周后DAS28評分下降情況，將患者分為臨床應答和臨床不應答兩個水平。臨床應答參考EULAR標準，定義為治療24周后DAS28評分下降≥1.2分。

1.4 PBMC中miR-146a表達檢測 采集RA患者基線期、12周、24周和對照組基線期外周血5 mL，EDTA抗凝，密度梯度離心法分離PBMC。采用實時熒光定量PCR法檢測miR-146a表達。使用TRIzol RNA分離試劑盒分離總RNA，然后逆轉錄合成cDNA。以U6作為miRNA內參，嚴格按照KAPA SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR試劑盒使用說明書進行實時定量PCR反應。引物序列：miR-146a上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCATG-3′，下游引物5′-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計算miR-146a的相對表達量。

2 結果

2.1 RA組和對照組PBMC中miR-146a表達比較 RA組和對照組PBMC中miR-146a的相對表達量分別為1.051(0.789，2.243)和2.906(1.860，3.953)，RA組PBMC中miR-146a表達高于對照組(P<0.01)。

2.2 RA患者TwHF治療前后PBMC中miR-146a表達變化 RA患者基線期、12周、24周時PBMC中miR-146a相對表達量分別為2.906(1.860，3.953)、2.296(1.456，4.183)和1.670(0.664，3.012)，12、24周時均較基線期下降，24周時較12周時下降(P均<0.01)。

2.3 RA患者TwHF治療臨床應答和臨床不應答者基線miR-146a表達比較 62例RA患者中，臨床應答34例，臨床不應答28例，二者基線期的miR-146a相對表達量分別為2.386(1.729，3.307)和3.240(2.015，4.174)，臨床應答者的基線期miR-146a表達高于臨床不應答者(P<0.05)。

2.4 RA患者TwHF治療臨床應答與不應答者的臨床指標比較 見表1。臨床應答者基線期CRP水平高于臨床不應答者(P=0.018)。

2.5 RA患者TwHF臨床應答的影響因素 將單因素Logistic回歸中P<0.1的因素進一步納入多因素Logistic回歸，結果顯示，miR-146a(P=0.205)和CRP(P=0.155)均與TwHF治療RA的臨床應答無關。見表2。

表1 RA患者TwHF臨床應答和不應答者的臨床指標比較

表2 影響臨床應答因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

miR-146家族主要包括miR-146a和miR-146b基因，兩個基因分別位于人的第5、10號染色體，兩者的成熟序列僅相差2個堿基，這兩個miRNA在有些細胞中功能相近，但miR-146a僅在Treg細胞中高度表達[5]。研究表明，miR-146a是參與炎性疾病發(fā)病機制的幾種miRNA之一。穩(wěn)態(tài)的miR-146a表達對于Th1細胞的反應及相關自身免疫性疾病起重要作用。其中，RA作為典型的Th1細胞反應及自身免疫性疾病受到眾多學者的關注。大量研究表明，miR-146a可以通過調節(jié)炎癥免疫應答來影響RA的進展。miR-146a過表達可能會抑制TRAF6、IRAK1的產生進而導致超免疫炎癥反應[6]；刺激Th1細胞產生IL-2、IL-12和干擾素γ(IFN-γ)來促進RA的炎癥[7]；通過NF-κB通路，誘導各種促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-17等的分泌[8]；以IL-17為靶向，促進T細胞的產生從而誘導RA患者的炎癥反應[8]。Mookherjee等[9]報道，RA患者PBMC中miR-146a和miR-155表達水平較正常人升高。Filipowicz等[10]報道，miR-146a在RA患者滑膜成纖維細胞(RASFs)中的表達水平高于骨關節(jié)炎患者。通過向體外RASFs培養(yǎng)基中添加一系列炎癥因子(IL-1、LPS、TNF-α)模擬RA的炎性環(huán)境，結果顯示，LPS和IL-1均可誘導miR-146a上調。由此推測，RA患者中可能由于發(fā)炎的滑膜中存在前炎癥細胞因子和趨化因子而導致miR-146a水平表達升高，miR-146a上調可能又通過核因子κB(NF-κB)通路，誘導各種促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-17等的分泌，或者刺激Th1細胞產生IL-2、IL-12、IFN-γ等，從多條通路促進RA的炎癥發(fā)展。本研究結果顯示，miR-146a在RA患者PBMCs中的表達水平高于對照組，與以往研究結果相符。提示miR-146a具有作為診斷RA生物標志物的潛能。

TwHF的主要有效成分是雷公藤甲素。研究顯示，雷公藤甲素可以降低免疫功能或宿主防御相關基因的表達，例如促炎細胞因子和趨化因子，包括TNF-α、IL-1β、CCL-1、CCL-2等。此外，既往研究表明，細胞間黏附分子1(ICAM-1)、層粘連蛋白等黏附分子以及NF-κB、激活轉錄因子3(ATFA3)等轉錄因子和信號轉導和轉錄激活因子5(STAT5)也能被TwHF抑制[11]。研究發(fā)現，RA患者接受TwHF治療后，miR-146a表達水平降低，且疾病活動減弱[12]。另有研究顯示，接受抗TNF藥物治療的RA患者和未接受抗TNF藥物治療的RA患者的miR-146a表達差異無統計學意義[6]。Abou-Zeid等[13]認為，其原因可能是抗TNF治療反應未完成，或者是僅一小部分患者對治療有應答。本研究結果顯示，TwHF治療可降低RA患者PBMC中miR-146a的表達水平。其原因可能是TwHF通過抑制RA患者NF-κB的表達，依賴NF-κB上調的miR-146a通路被阻斷，致使miR-146a表達下調或無法上調，從而減少炎性因子的分泌，進而達到緩解RA的作用。

關于miR-146a表達水平對TwHF治療RA應答的影響目前研究較少。本研究發(fā)現，臨床應答者基線期miR-146a表達水平高于臨床不應答者，提示miR-146a表達水平升高可能影響TwHF治療RA的臨床應答。其可能原因有：①miR-146a是一個很強的促炎因子，其含量越高表明患者炎癥越重，疾病活動度越高。因此，疾病活動度高的RA患者有更大的DAS28下降空間，更容易達到臨床應答。②miR-146a高表達可能與患者對TwHF治療的敏感性有關，但目前尚無研究證明，需要我們進一步研究觀察。單因素Logistic回歸顯示,miR-146a和CRP與臨床應答均有關聯，因此在多因素Logistic回歸時兩者可能相互干擾，未得到miR-146a對RA患者TwHF治療應答的獨立相關作用。

本研究存在一定的局限性：①本研究中RA患者在接受TwHF的同時合用MTX或LEF進行治療，這對結果可能存在干擾。但本研究入組患者為經單獨使用MTX或LEF治療效果不佳的患者，因此其聯合使用對研究結果影響較小，并且我們采用了單因素及多因素回歸分析來排除MTX或LEF聯用對結果的干擾。②本研究樣本量相對較小，僅納入62例患者，因此缺乏統計效能。③本研究隨訪周期較短，因此miR-146a對TwHF治療RA患者的長期療效的影響未能評估。

綜上所述，RA患者PBMCs中miR-146a表達水平上調，其基線期表達水平升高可能影響TwHF治療RA的臨床應答。