結直腸腺癌組織中長鏈非編碼RNA linc00511表達變化及意義

劉鑫，武雪亮，薛軍

(河北北方學院附屬第一醫院，河北張家口075000)

全球每年結腸直腸癌死亡患者超過50萬人[1]，遠處轉移是其主要死因。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，不具有蛋白質編碼潛力。最近研究表明，lncRNA在不同的生物過程中起關鍵作用，包括選擇性剪接、基因印跡、核內運輸、細胞分化和RNA衰變等[2,3]。有研究表明，lncRNA SOX21-AS1在結直腸癌組織中高表達，并且是導致患者預后不良的原因之一，并通過募集和結合miR-145-MYO6促進腫瘤生長[4]；lncRNA ZFAS1通過結合miR-484促進結直腸癌的腫瘤生長和浸潤轉移[5]；另一個重要的lncRNA HOTAIR可以調控多梳蛋白依賴性染色質修飾，并且與結直腸癌預后不良有關[6]。據文獻報道，linc00511在小細胞肺癌組織中高表達，并且通過結合EZH2抑制p57進而促進小細胞肺癌的侵襲遷移[7]。然而，linc00511在結腸癌組織中的表達水平及其功能尚未研究。因此，本研采用實時定量PCR法檢測linc00511在結直腸腺癌組織中的表達情況，并分析其與臨床病理參數及預后的關系，為結直腸腺癌的早期診斷及靶基因治療提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取河北北方學院附屬第一醫院2011年1月～2012年1月確診的50例結直腸腺癌患者的癌組織及其對應癌旁組織標本。患者中男27例，女23例；年齡30～83歲，其中≤55歲19例、>55歲31例；腫瘤直徑<5 cm 27例，≥5 cm 23例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期24例，Ⅲ、Ⅳ期26例；組織分化程度高分化21例、中低分化29例；淋巴結轉移21例，無淋巴結轉移29例；遠處轉移12例，無遠處轉移38例。術后隨訪至2017年2月20日，死亡28例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者術前均未接受除手術外的其他治療，均簽署知情同意書。

1.2 結直腸腺癌及癌旁組織中linc00511檢測方法 采用實時定量PCR法。提取組織中的總RNA，加入500 μL TRIzol試劑裂解，收集到1.5 mL無酶EP管。加入100 μL氯仿，室溫靜置3 min，12 000 r/min離心15 min；將200 μL上層液體移入新的1.5 mL EP管中，加入250 μL異丙醇，混勻，靜置10 min；12 000 r/min離心10 min，棄上清液，以 75%乙醇溶液(含DEPC)洗滌沉淀3次(7 500 r/min離心5 min)；待RNA沉淀基本透明時，加入ddH2O至充分溶解，測定RNA的質量及濃度。按照Takara RR036A試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，以使用CFX96實時PCR檢測系統測定linc00511。linc00511上游引物5′-TCTCCTTGTGCAAACCTCC-3′，下游引物5′-CCCACATTGAGCGAATGCC-3′；內參GAPDH上游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATT-TC-3′，下游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′。反應體系(10 μL)：2×iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix 5 μL，上、下游引物(0.4 μmol/L)各0.4 μL，cDNA 0.8 μL，RNase Free H2O 3.8 μL。反應條件：預變性95 ℃，30 s；變性95 ℃，5 s，退火/延伸60 ℃，30 s，共40個循環，65～95 ℃熔解曲線分析。每次3個復孔，重復3次。目的基因的表達應用2-ΔΔCt法進行相對定量，中位數以上為高表達，中位數以下為低表達。

2 結果

2.1 結直腸腺癌及癌旁組織中linc00511表達比較 結直腸腺癌組織中linc00511表達量為3.20±1.29，高于癌旁組織中的1.21±0.92(P<0.01)。

2.2 linc00511表達與結直腸腺癌患者臨床病理參數的關系 淋巴結轉移和遠處轉移的結直腸腺癌組織中linc00511高表達者高于無淋巴轉移、無遠處轉移者(P均<0.05)，而不同性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度、TNM分期間差異無統計學意義。見表1。

表1 linc00511表達與結直腸腺癌患者臨床病理參數的關系(例)

2.3 linc00511表達與結直腸腺癌患者預后的關系 linc00511高表達和低表達者的5年生存率分別為40%(10/25)、72%(18/25)，linc00511高表達者5年生存率低于低表達者(P<0.05)。

3 討論

結直腸癌是一種常見的消化道腫瘤，也是癌癥相關死亡的主要原因之一[8～10]。約20%的結直腸癌患者在診斷時已經轉移[11]，在晚期結直腸癌患者中更常見，通常傳播到肝臟和肺。事實上，轉移是結直腸癌患者癌癥相關死亡的主要原因之一[12,13]。研究結直腸癌的進展和轉移的分子機制，可為臨床尋找更好的結直腸癌治療新靶點。

結直腸癌的發生發展是一個多階段、多影響因素的復雜過程。很多學者對其發生機制進行了研究,近來lncRNA吸引了世界范圍內研究人員的巨大興趣。許多lncRNA在人類腫瘤發生中異常表達并充當調節劑，已報道多種lncRNA在結直腸癌發生中起重要作用。例如：H19通過結合eIF4A3促進結直腸癌的發生發展[14]；RP4通過發揮海綿作用吸附miR-7-5p促進結腸癌進展[15]；GAPLINC通過miR-34a/c-MET信號通路調節結腸癌細胞的侵襲和遷移能力[16]。

近期研究發現，linc00511可通過結合EZH2抑制p57，進而促進小細胞肺癌的侵襲遷移[7]。本研究發現，結直腸腺癌組織中linc00511表達量高于正常結直腸組織，與Sun等[7]研究結果相似，提示linc00511在結直腸癌中可能充當一個促癌基因的作用。本研究將linc00511在結直腸癌腫瘤組織中的表達水平從低到高排序，中位數以上為高表達、以下為低表達，分析linc00511與結直腸癌患者臨床病理特征與預后的關系。結果發現，有淋巴結轉移和遠處轉移者linc00511高表達比例高于無轉移者，而不同性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度和TNM分期間差異無統計學意義。這提示linc00511可能是促進結直腸癌發生轉移的重要原因之一，有望成為預測結直腸癌患者是否有轉移的因子之一。本研究還發現，linc00511高表達者的5年生存率低于低表達者。這提示linc00511的高表達是結腸癌患者的預后危險因素，可作為判斷結直腸癌預后的指標之一，是潛在的治療靶點。

綜上所述，本研究結果提示linc00511在結直腸癌發生發展中起重要作用，尤其在判斷結直腸癌患者轉移和預后中具有潛在的應用價值，為我們在結直腸癌患者的治療提供了新的思路，為結直腸癌的靶向治療提供了理論基礎。