脾氣虛大鼠海馬神經元線粒體呼吸鏈功能及Lon蛋白酶表達變化及意義

馬丹，劉文俊，于化新，王凌志，劉旭東，劉慧慧，王路，柴紀嚴，單德紅

(遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽110847)

中醫(yī)認為，脾主運化，在志為思，而海馬能夠調控消化吸收，又是情緒、思維和學習記憶等形成的重要部位，因此脾與海馬關系密切，實驗也證實二者確有關聯(lián)[1，2]。線粒體是細胞動力工廠，線粒體DNA(mtDNA)與核DNA共同編碼呼吸鏈復合體(C)Ⅰ、Ⅲ～Ⅴ。線粒體通過維持其蛋白質的正確折疊組裝和錯誤折疊蛋白降解的平衡來達到線粒體穩(wěn)態(tài)，即線粒體蛋白質控。與核DNA相比，mtDNA極易突變而致上述蛋白錯誤折疊，發(fā)生未折疊蛋白反應，如不及時干預則抑制ATP合成，甚至促進反應性氧簇(ROS)產生，引起細胞凋亡[3～5]。線粒體內存在Lon蛋白酶，能夠分解這類異常蛋白，發(fā)揮蛋白質控作用[6，7]。研究發(fā)現(xiàn)，脾氣虛大鼠海馬線粒體損傷、產能減少[2，8]，但是否發(fā)生了未折疊蛋白反應還不清楚。2015年1月～2017年12月，我們觀察了脾氣虛大鼠海馬神經元線粒體內蛋白積聚情況，并檢測線粒體呼吸鏈功能變化及Lon蛋白酶表達情況，從線粒體蛋白質控方面探討脾氣虛的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 SPF級雄性SD大鼠16只，體質量(200±10)g，購于遼寧省本溪巿實驗動物中心。ATP測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，大鼠ROS檢測ELISA試劑盒(Tsz Biosciences)，線粒體呼吸鏈復合物活性檢測試劑盒(北京索萊寶生物技術有限公司)，抗Lon蛋白酶1多克隆抗體(Proteintech)。日本電子JEM-1011透射電鏡，iMark酶標儀(美國Bio-Rad)，電泳儀(美國Bio-Rad)。

1.2 動物分組與模型制備 大鼠置于室溫18～23 ℃，相對濕度45%～55%，自由飲水進食，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。將大鼠按照隨機數(shù)字表法分為正常組和模型組各8只。正常組正常飲食水。模型組參照文獻[9]方法復制脾氣虛證模型，即15 d內給予飲食失節(jié)(飽食1 d，禁食2 d，不禁水)和每日勞倦刺激(水溫35～37 ℃游泳至力竭)，當大鼠出現(xiàn)消瘦、食少、神疲和乏力時為模型制作成功。

1.3 海馬神經元線粒體蛋白積聚情況觀察 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，快速開顱取海馬。將大部分置于-80 ℃凍存?zhèn)溆?，少部分? ℃下切成約1 mm3小塊，2.5%戊二醛固定，PBS漂洗，1%鋨酸固定，乙醇、丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋聚合，LKB-1型超薄切片機切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染，透射電鏡觀察線粒體內高密度斑塊情況并拍片。

1.4 海馬線粒體呼吸鏈CⅠ～CⅣ活性、ATP和ROS水平檢測 CⅠ～CⅣ活性、ATP檢測采用比色法，ROS檢測采用ELISA法。取凍存的海馬組織，制備組織勻漿，應用Bio-Rad美國伯樂iMark酶標儀檢測，嚴格按照說明書操作。

1.5 海馬線粒體呼吸鏈CⅤ和Lon蛋白酶表達檢測 采用Western blotting法。取凍存保存的海馬組織20～40 mg，加入200 μL裂解液，冰上研磨后置于EP管中4 ℃離心10 min，吸取上清液。BCA法測定蛋白濃度后，每管加入2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液100 μL，100 ℃變性，按50 μg總蛋白上樣量計算加樣體積，SDS-PAGE凝膠電泳并轉膜和切膜，37 ℃水浴5%脫脂奶粉/TBST封閉2 h，加入1∶1 000和1∶2 000的抗Lon蛋白酶1多克隆抗體和CⅤ抗體稀釋液4 mL，4 ℃搖床過夜。TBST洗膜，加入4 mL HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，GAPDH盒內加入4 mL HRP標記山羊抗鼠二抗(1∶5 000)，室溫搖床孵育1.5 h。TBST洗膜，加入ECL發(fā)光液，曝光顯影。應用AlphaView SA軟件檢測蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 兩組海馬神經元線粒體內異常蛋白積聚情況比較 正常組線粒體內部高密度斑塊較少，而模型組線粒體內部高密度斑塊則較多。

2.2 兩組海馬神經元線粒體呼吸鏈功能比較 見表1。模型組CⅣ活性、CⅤ表達和ATP水平均低于正常組(P<0.05或<0.01)，其他指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

表1 兩組海馬神經元線粒體呼吸鏈功能比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 兩組海馬神經元線粒體Lon蛋白酶表達比較 正常組與模型組Lon蛋白酶的相對表達量分別為0.249±0.080、0.169±0.057，模型組低于正常組(P<0.05)。

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)理論指出，脾能夠將食物轉化為精微物質，生成氣血后為機體利用?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，食物中的營養(yǎng)物質在胃腸道消化吸收后，要經過線粒體的氧化磷酸化才能產生ATP，進而供給細胞。因此認為，中醫(yī)的脾與線粒體存在密切聯(lián)系。脾氣虛是臨床常見證型，以食少、消瘦、腹脹和神疲乏力等為主要癥狀，關于其發(fā)生機制的研究雖然較多，但涉及海馬神經元線粒體的報道較少[1，8]。海馬是整合內臟功能與情緒、思維和學習記憶的高級中樞結構，能量供給不足將引起其功能紊亂[10，11]。線粒體產能主要依賴呼吸鏈CⅠ、Ⅲ～Ⅴ的協(xié)同作用，而這些蛋白異常可導致ROS等過度產生，使線粒體由動力工廠變成毒物工廠。研究表明，mtDNA存在上述復合物的7、1、3和2個編碼基因[12，13]，但由于缺乏組蛋白保護且靠近氧化磷酸化場所，mtDNA極易突變，從而導致包括上述成分在內的許多蛋白發(fā)生錯誤折疊，如不及時清除而大量積聚，就會損傷線粒體功能，甚至誘發(fā)氧化應激等嚴重反應[14～17]。

研究表明，Lon蛋白酶能夠清除線粒體內異常蛋白，修復mtDNA，維持線粒體穩(wěn)態(tài)[6，7]，但其在脾氣虛中的作用卻少有研究。本研究首先進行形態(tài)學觀察，以驗證脾氣虛時線粒體內是否存在異常蛋白積聚現(xiàn)象。電鏡結果顯示，正常組與模型組內均存在此種現(xiàn)象，但模型組要更嚴重。正常組海馬神經元線粒體內出現(xiàn)少量蛋白積聚，表明即使在正常情況下，海馬神經元的mtDNA也有突變現(xiàn)象，只是比較輕微，其原因可能是部分線粒體衰老或mtDNA受到了某些外來刺激；模型組出現(xiàn)大量蛋白積聚，提示脾氣虛時海馬神經元mtDNA突變嚴重，導致異常蛋白過多。其次在呼吸鏈方面，本研究顯示模型組CⅣ活性和CⅤ表達顯著下降，同時ATP含量明顯減少，但ROS水平升高不明顯，表明脾氣虛時海馬神經元線粒體呼吸鏈只是部分受損。由于CⅣ和CⅤ是ATP合成的關鍵環(huán)節(jié)，其表達下降對于ATP生成影響較大，這也可能是模型組ATP含量明顯低于正常組的重要原因。

基于以上形態(tài)學與功能兩方面的結果，可以推測脾氣虛時海馬神經元mtDNA發(fā)生了突變，導致了相關蛋白錯誤折疊，影響了呼吸鏈功能，但還未出現(xiàn)氧化應激反應，因此及時清除異常蛋白就顯得極為必要。在線粒體的蛋白質控體系中，Lon蛋白酶較受關注。研究發(fā)現(xiàn)，Lon蛋白酶屬于AAA+超家族，是一種同質寡聚環(huán)狀的蛋白酶,在古生菌、原核生物和真核生物線粒體中高度保守，其突變可引起異常蛋白質降解缺陷[6，18]。Lon蛋白酶含量N端結構域、ATP酶結構域和P結構域，主要通過前二者識別并結合底物，后者完成蛋白降解。脾氣虛時Lon蛋白酶表達的研究目前還未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，正常組Lon蛋白酶表達較高，而模型組則明顯降低，表明正常情況下，海馬神經元線粒體內存在較多的Lon蛋白酶，可以應對異常蛋白錯誤折疊并及時清除，以保證線粒體產生充足ATP，而脾氣虛時Lon蛋白酶不足，導致異常蛋白降解延遲，從而影響了呼吸鏈的產能。因此本研究認為，海馬神經元內線粒體蛋白質控水平下降與脾氣虛的發(fā)生有關。