脫氫表雄酮對高脂誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2表達(dá)的影響及CYP19在其中的作用

周穎，李桃，肖芳，黃江梅，趙敏

(秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島066000)

動脈粥樣硬化是一種常見病、多發(fā)病。研究顯示，雌激素具有抗動脈粥樣硬化作用，但用其治療可引起乳腺及子宮病變。雄激素可通過被細(xì)胞降解為雌激素后發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用，但雄激素可引起前列腺肥大等不良反應(yīng)。脫氫表雄酮(DHEA)是一種弱的雄激素，多數(shù)研究認(rèn)為DHEA有抗動脈粥樣硬化的作用[1，2]，目前國外已將DHEA補(bǔ)充治療應(yīng)用于臨床。DHEA在體內(nèi)主要通過轉(zhuǎn)化為雌酮而發(fā)揮作用，細(xì)胞色素P450芳香酶(CYP19)是DHEA轉(zhuǎn)化為雌酮的關(guān)鍵酶，增強(qiáng)血管壁細(xì)胞內(nèi)CYP19的表達(dá)，可以特異性地加強(qiáng)DHEA在血管局部的抗動脈粥樣硬化作用。基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，在動脈粥樣硬化形成過程中發(fā)揮重要作用[3，4]。2017年8～12月，我們觀察了DHEA對高脂誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中MMP-2表達(dá)的影響，并通過轉(zhuǎn)染含有CYP19基因的質(zhì)粒，觀察DHEA抗動脈粥樣硬化作用的效果以及CYP19在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 HUVEC的原代培養(yǎng) 無菌條件下取分娩4 h內(nèi)健康新生兒臍帶，采用胰酶消化法從臍靜脈獲取內(nèi)皮細(xì)胞。用含15%胎牛血清、50 μg/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的M199培養(yǎng)基(Gibco公司)培養(yǎng)HUVEC，用0.1%胰蛋白酶傳代。

1.2 HUVEC分組與處理 將生長良好的細(xì)胞換用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，分為4組。正常對照組予以DMEM/F12培養(yǎng)基；ox-LDL組予以DMEM/F12培養(yǎng)基+30 mg/L ox-LDL；DHEA組予以DMEM/F12培養(yǎng)基+1 μmol/L DHEA；ox-LDL+DHEA組予以DMEM/F12培養(yǎng)基+30 mg/L ox-LDL+1 μmol/L DHEA。各組HUVEC均作用24 h。

1.3 HUVEC中MMP-2 mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時熒光定量PCR法。用TRIzol一步法提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將獲得的cDNA按照實(shí)時熒光定量PCR試劑盒說明書方法擴(kuò)增目的基因。MMP-2上游引物：5′-TACGATGATGACCGCAAGT-3′，下游引物：5′-AGTCCGCCAAATGAACC-3′；GAPDH上游引物：5′-GCTGGGGCTCACCTGAAGGG-3′，下游引物：5′-GGATGACCTTGCCCACAGCC-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min ；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s， 68 ℃ 20 s，40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)的相對量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 HUVEC中MMP-2蛋白表達(dá)檢測 采用ELISA法。取各組細(xì)胞，加入1 mol/L NaOH裂解，用Lowry法進(jìn)行蛋白定量。向細(xì)胞中加入4%多聚甲醛固定，正常血清封閉，加羊抗人MMP-2多克隆抗體(1∶400)，4 ℃孵育48 h，使用兔抗羊SP試劑盒檢測MMP-2蛋白。用酶標(biāo)儀在490 nm下檢測各孔細(xì)胞的吸光度A值。用細(xì)胞A值與細(xì)胞蛋白含量的比值表示MMP-2蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 HUVEC細(xì)胞CYP19基因的轉(zhuǎn)染 將HUVEC接種于6孔板中，M199+15%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000進(jìn)行CYP19基因體外質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。分別取無血清DMEM/F12培養(yǎng)基250 μL于兩只潔凈的EP管中，各加入4 μg DNA及8 μL LipofectamineTM2000，混勻室溫靜置5 min后將兩者混合，室溫放置20 min后移至6孔板中，6 h后移去培養(yǎng)液，更換為M199+15%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.6 CYP19基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分組 將轉(zhuǎn)染后的HUVEC用M199+15%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，更換無血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，然后分組：①CYP19組：轉(zhuǎn)染CYP19的HUVEC+無血清DMEM/F12培養(yǎng)基；②CYP19+ox-LDL組：轉(zhuǎn)染CYP19的HUVEC+無血清DMEM/F12培養(yǎng)基+30 mg/L ox-LDL；③CYP19+ox-LDL+DHEA組：轉(zhuǎn)染CYP19的HUVEC+無血清DMEM/F12培養(yǎng)基+30 mg/L ox-LDL+1 μmol/L DHEA；④空質(zhì)粒組：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HUVEC+無血清DMEM/F12培養(yǎng)基；⑤空質(zhì)粒+ox-LDL組：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HUVEC+無血清DMEM/F12培養(yǎng)基+30 mg/L ox-LDL；⑥空質(zhì)粒+ox-LDL+DHEA組：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HUVEC+無血清DMEM/F12培養(yǎng)基+30 mg/L ox-LDL+1 μmol/L DHEA。均培養(yǎng)24 h。

1.7 轉(zhuǎn)染細(xì)胞MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)檢測 采用實(shí)時熒光定量PCR檢測各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞MMP-2 mRNA的表達(dá)，方法同1.3；用ELISA法檢測各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞MMP-2蛋白的表達(dá)，方法同1.4。

2 結(jié)果

2.1 各組HUVEC中MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)比較 見表1。ox-LDL組MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)高于正常對照組，ox-LDL+DHEA組較ox-LDL組降低(P均<0.05)，DHEA組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

表1 各組HUVEC中MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與ox-LDL組比較，*P<0.05；與ox-LDL+DHEA組比較，#P<0.05。

2.2 各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)比較 CYP19+ox-LDL+DHEA組MMP-2 mRNA及蛋白的表達(dá)與空質(zhì)粒+ox-LDL+DHEA組相比均降低(P均<0.05)，CYP19組與空質(zhì)粒組MMP-2 mRNA及蛋白的表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)，CYP19+ox-LDL組與空質(zhì)粒+ox-LDL組MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)，CYP19+ox-LDL組MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)均高于CYP19組(P均<0.05)，CYP19+ox-LDL+DHEA組MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)與CYP19+ox-LDL組相比均降低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與CYP19+ox-LDL組比較，*P<0.05；與CYP19+ox-LDL+DHEA組比較，#P<0.05。

3 討論

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，是由多因素參與的復(fù)雜的慢性病理過程。MMP-2能分解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，影響內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及單核細(xì)胞的黏附、遷移、增殖等，廣泛參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，性激素對動脈粥樣硬化具有一定的影響[6]。在老年男性和更年期婦女，高水平的DHEA與頸動脈內(nèi)膜-中膜厚度呈負(fù)相關(guān)，提示DHEA與老年人頸動脈粥樣硬化的危險性呈負(fù)相關(guān)。沈忠海等[7]研究認(rèn)為，DHEA是冠心病發(fā)病的影響因子。葉漫湘[8]發(fā)現(xiàn)，DHEA聯(lián)用辛伐他汀可改善動脈粥樣硬化。Bednarek等[9]報道，DHEA可以減少高膽固醇喂飼兔的動脈壁脂紋面積。

MMP-2又稱明膠酶A，它表達(dá)廣泛，能夠降解明膠、多種膠原和基底膜成分[10]。MMP-2通過降解包繞中層平滑肌的細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)血管中層平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移，參與了內(nèi)膜的增生，為形成動脈粥樣硬化斑塊提供條件。動脈粥樣硬化發(fā)生時，ox-LDL等因素誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌MMP-2降解基底膜，有利于單核細(xì)胞入侵；循環(huán)中的單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附時，一方面，單核細(xì)胞的黏附促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌MMP-2，另一方面，分泌的MMP-2反過來又促進(jìn)單核細(xì)胞在血管壁中的遷移，從而加速動脈粥樣硬化的發(fā)展[11]。MMP-2還可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)削弱斑塊表面纖維帽成分，使斑塊易于發(fā)生破裂[12]。MMP-2在動脈粥樣硬化中的作用越來越受到人們關(guān)注，甚至被認(rèn)為是治療動脈粥樣硬化及防治并發(fā)癥的靶分子。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL+DHEA組MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)較ox-LDL組降低，提示DHEA能特異性抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC MMP-2的表達(dá)，其機(jī)制可能與DHEA發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用有關(guān)。

DHEA在體內(nèi)主要通過轉(zhuǎn)化為雌酮而發(fā)揮作用，而CYP19是DHEA轉(zhuǎn)化為雌酮的關(guān)鍵酶[13，14]。CYP19是細(xì)胞色素P450家族成員之一，普遍存在于細(xì)胞中[15]。Marder等[16]研究認(rèn)為，DHEA在細(xì)胞內(nèi)主要被CYP19降解而進(jìn)一步發(fā)揮作用。Yoneyama等[17]發(fā)現(xiàn)，DHEA的抗血管內(nèi)皮細(xì)胞增生作用是通過CYP19降解為雌激素而發(fā)揮的。Hayashi等[18]通過給予切除卵巢后的白兔不同飲食來研究DHEA抗動脈粥樣硬化的機(jī)制，結(jié)果表明DHEA的抗動脈粥樣硬化作用是通過CYP19轉(zhuǎn)化為雌二醇而發(fā)揮的，并且雌二醇的抗動脈粥樣硬化作用可能是通過NO發(fā)揮的。過表達(dá)CYP19基因能夠增強(qiáng)DHEA抑制高脂誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)的作用，從而增強(qiáng)DHEA的抗動脈粥樣硬化作用。本研究將CYP19和空質(zhì)粒分別體外轉(zhuǎn)染至HUVEC，之后給予ox-LDL誘導(dǎo)及DHEA干預(yù)，結(jié)果顯示，CYP19+ox-LDL+DHEA組MMP-2 mRNA及蛋白的表達(dá)與空質(zhì)粒+ox-LDL+DHEA組相比均明顯降低。表明過表達(dá)CYP19基因使DHEA大量轉(zhuǎn)化為雌酮，進(jìn)而抑制高脂誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

綜上所述，DHEA能夠抑制高脂誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)，這可能是其發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用的機(jī)制之一；過表達(dá)CYP19能夠增強(qiáng)DHEA的這一作用。