下調高遷移率族蛋白B1對宮頸癌細胞侵襲、遷移的影響及機制

楊群，李麗

(1四川省人民醫(yī)院，成都610072；2四川大學華西醫(yī)院)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內婦科惡性腫瘤中發(fā)病率位居第二，全球平均每年有53萬新發(fā)宮頸癌病例，宮頸癌總體病死率達50%，其中發(fā)展中國家的宮頸癌病死率超過85%[1]。宮頸癌的復發(fā)及轉移是影響宮頸癌患者預后的重要原因[2]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)在多種腫瘤中存在過表達，與腫瘤發(fā)生及預后相關[3～5]。HMGB1在宮頸癌中也存在過表達，并且與宮頸癌轉移和復發(fā)等惡性腫瘤表型密切相關，是宮頸鱗狀細胞癌早期診斷的預測指標和獨立預后因素[6，7]。胞外釋放的HMGB1與細胞膜上的Toll樣受體4(TLR4)結合，可以激活下游信號傳導通路，如磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、核因子-кB(NF-кB)通路，這將導致基因的過表達以及腫瘤細胞生物學行為的改變。然而，宮頸癌細胞外釋放的HMGB1能否與宮頸癌細胞膜上的TLR4結合并激活TLR4/NF-κB和TLR4/PI3K/Akt信號通路，以及對宮頸癌細胞侵襲和遷移能力產生的影響還不清楚。2017年10月～2018年1月，我們觀察了下調HMGB1對TLR4/NF-κB和TLR4/PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的影響，及其對宮頸癌細胞侵襲、遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌SiHa細胞購自美國Hyclone生物公司。DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone生物公司)，正丁酸鈉(美國Sigma-Aldrich試劑公司)，GAPDH(海基生物科技有限公司)，HMGB1、TLR4等抗體(美國Abcam試劑公司)，兔抗鼠GAPDH單克隆抗體(美國Cell Sigaling Technology試劑公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG(美國Cell Sigaling Technology公司)，牛血清白蛋白(BSA，美國Sigma生物科技公司)，溴酚藍(BPB，上海信帆生物科技公司)，Tris-HCl(湖北武漢博士德生物工程公司)，Tris(中國Biosharp生物科技)，SDS-PAGE凝膠試劑盒(湖北武漢拜意爾生物)，BCA蛋白濃度檢測試劑盒(美國Thermo公司)，ECL化學發(fā)光顯色試劑盒(湖北武漢谷歌生物公司)，MTT檢測試劑盒(南京凱基生物公司)，Transwell小室模型(BD Biosciences有限公司)，SYBR?Premix Ex TaqTM(日本TaKaRa生物工程公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 將SiHa細胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內孵育，經(jīng)過3～4次細胞傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。將細胞分為對照組和實驗組，對照組加入0.01% DMSO、實驗組加入HMGB1抑制劑正丁酸鈉0.5 mmol/L處理24 h。

1.3 細胞遷移和侵襲能力觀察 采用Transwell小室實驗。將基質膠加入Transwell小室上室，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置成膠；下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)30 min。將兩組細胞加入胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按1×104/孔加入上室。24 h后以4%多聚甲醛固定15 min，蘇木素染色10 min，自來水沖洗，伊紅染色2～3 min，蒸餾水沖洗。用手術刀片沿外周切下Transwell膜，置于載玻片上，中性樹膠封片。隨機選出10個視野在顯微鏡下觀察、拍照，計數(shù)每個視野下的完整細胞數(shù)，取平均值，實驗重復3次。遷移實驗步驟同侵襲實驗，Transwell小室無需進行鋪膠處理，細胞數(shù)目為1×105/孔。以穿膜細胞數(shù)表示細胞的遷移和侵襲能力。

1.4 HMGB1及TLR4/NF-кB信號通路相關分子[TLR4、NF-кB、整合素av、整合素β3、原肌球蛋白1(TPM1)、絲氨酸蛋白酶抑制劑(maspin)]、TLR4/PI3K/Akt信號通路相關分子(p-PI3K、p-Akt、整合素β1)mRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。采用TRIzol法提取兩組細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。取PCR產物各10 μL，于EB染色的1.5%瓊脂糖凝膠40 V恒壓電泳50 min，取出凝膠后在凝膠成像分析系統(tǒng)進行拍照并分析。以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.5 HMGB1及TLR4/NF-κB、TLR4/PI3K/Akt信號通路相關分子蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取對數(shù)生長期細胞，加入胰蛋白酶消化，制成細胞懸液。移入直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細胞貼壁生長。向培養(yǎng)皿內加入I3C，終濃度分別為0、100、200、300 μmol/L。于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白，BCA定量法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，轉PVDF膜；封閉2 h后，加入1∶1 000配置的一抗，4 ℃孵育過夜；洗膜后加入1∶8 000的羊抗兔二抗(過氧化物酶HRP標記)，室溫下孵育；洗膜后進行ECL顯色，按照ECL顯色試劑盒進行操作。以目的蛋白與內參灰度比值表示各蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 兩組細胞遷移和侵襲能力比較 對照組遷移和侵襲實驗中的穿膜細胞數(shù)分別為(80.8±1.8)、(55.2±2.9)個，實驗組分別為(62.4±1.1)、(42.2±2.4)個。實驗組穿膜細胞數(shù)均少于對照組(P均<0.05)。

2.2 兩組TLR4/NF-κB和TLR4/PI3K/Akt信號通路相關分子mRNA表達比較 與對照組相比，實驗組HMGB1、TLR4、NF-кB p65、整合素av、整合素β3、整合素β1 mRNA表達下降，TPM1、maspin mRNA表達升高(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組TLR4/NF-κB和TLR4/PI3K/Akt信號通路相關分子mRNA表達比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.3 兩組TLR4/NF-κB和TLR4/PI3K/Akt信號通路相關分子蛋白表達比較 與對照組相比，實驗組HMGB1、TLR4、NF-кB p65、整合素av、整合素β3、整合素β1蛋白表達下降，TPM1、maspin蛋白表達升高(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組TLR4/NF-κB和TLR4/PI3K/Akt信號通路相關分子蛋白表達比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

HMGB1可以促進腫瘤細胞侵襲和遷移，影響宮頸癌患者的預后。Li等[8]報道，沉默HMGB1的表達可有效抑制胃癌細胞的侵襲和轉移。Chen等[9]采用cDNA微矩陣法檢測高侵襲性和低侵襲性的卵巢癌細胞株基因表達的差異，證實HMGB1在卵巢癌高侵襲株中的表達顯著高于低侵襲株中的表達，且在敲除HMGB1基因后，有效抑制了細胞的侵襲和遷移。我們的前期研究顯示，對于宮頸癌患者，HMGB1的外釋放可以促進宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力。另外，作為HMGB1的受體，TLR4下游許多信號通路與腫瘤細胞的侵襲和遷移能力相關[10]。

本研究觀察了宮頸癌細胞中HMGB1對TLR4/NF-кB信號通路相關分子(TLR4、NF-кB、整合素av、整合素β3、TPM1、maspin)、TLR4/PI3K/Akt信號通路相關分子(p-PI3K、p-Akt、整合素β1)以及宮頸癌細胞侵襲和遷移能力的影響。結果顯示，在宮頸癌細胞中，抑制HMGB1的表達可以下調TLR4下游信號通路的表達，從而抑制宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力。在宮頸癌細胞中，HMGB1可以通過與TLR4結合，激活TLR4/NF-кB相關的信號傳導通路，促進宮頸癌細胞侵襲遷移能力。NF-кB信號通路與腫瘤細胞的侵襲和遷移能力有密切聯(lián)系。多項實驗證明，HMGB1可能通過調控NF-кB信號通路來影響腫瘤的生長[11]。Jube等[12]研究表明，在惡性間皮瘤中，HMGB1可以通過激活NF-кB信號傳導通路增加腫瘤的惡性程度和促進轉移。有研究報道，HMGB1可以通過激活NF-кB相關的信號傳導通路促進腫瘤細胞遷移能力[11]。Eiro等[13]研究證實，TLR4可以通過NF-кB信號通路在結腸癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Liao等[14]研究表明，在轉移的乳腺癌細胞中，激活的TLR4可以通過NF-кB信號傳導通路促進整合素avβ3介導的乳腺癌細胞的黏附和侵襲性轉移。整合素是細胞黏附分子家族的重要成員，主要通過介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質(ECM)之間的相互黏附，并介導細胞與ECM之間的雙向信號傳導而發(fā)揮其作用。整合素αvβ3由av和β3亞單位組成，可以與多種配體結合，表現(xiàn)在多種細胞中，參與到腫瘤的侵襲轉移、血管生成、傷口愈合、凝血和炎癥等生理以及病理的過程中。整合素對腫瘤血管生成起著重要作用，多種腫瘤表面和新生血管內皮細胞中整合素有較高的表達。在眾多的整合素中，整合素αvβ3的作用尤其重要。Liao等[14]研究表明，整合素avβ3是血流中介導腫瘤細胞停滯和侵襲性遷移的過程中的關鍵整合素。在乳腺癌中，整合素avβ3在侵襲性腫瘤和轉移灶中表達上調，故可以用整合素avβ3來描繪轉移性表型。整合素avβ3表達水平可能顯著影響血流中乳腺癌細胞停滯和轉移能力。研究顯示，TLR4的配體可能在轉移性乳腺癌中通過激活NF-кB信號通路而促進整合素avβ3的表達。研究結果中，使用HMGB1抑制劑的SiHa細胞中，TPM1和maspin表達量降低。腫瘤細胞侵襲性遷移可能受到TPM1和maspin的限制，這兩者都可以阻斷基質蛋白水解作用來抑制腫瘤細胞的侵襲。在乳腺癌細胞MDA-MB-231中提高TPM1或者maspin的表達可以抑制細胞的侵襲及遷移。研究顯示，TLR4信號通路能夠調節(jié)這些基因以及整合素avβ3的表達，由此來促進轉移性乳腺癌細胞侵襲及遷移。TLR4信號通路通過激活NF-кB來降低TPM1和maspin表達。然而這些基因并不是NF-кB直接的靶向基因，因為NF-кB并不會影響這些基因的轉錄活動。NF-кB事實上是通過上調腫瘤細胞中miR-21的表達來降低TPM1和maspin表達。NF-кB可以被一些致癌基因激活，持續(xù)的NF-кB激活可以在大多數(shù)乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)。而TLR4信號通路可以進一步增加NF-кB的激活。

本研究顯示，在宮頸癌細胞中HMGB1可以通過與TLR4結合，激活TLR4/PI3K/Akt相關的信號傳導通路，促進宮頸癌細胞侵襲和遷移能力。PI3K/Akt信號通路與腫瘤細胞的侵襲和遷移能力有密切聯(lián)系。有研究表明，Akt信號通路在惡性腫瘤的進展中有重要作用[15]。Akt在所有類型的細胞和組織中都有表達。Akt可以提高細胞存活率并成為有效的抗腫瘤靶標。臨床上Akt的活性增加可以導致胃癌的進展和細胞增殖，而且Akt也參與到神經(jīng)膠質細胞的細胞存活和增殖的信號傳導通路中。由此可知阻斷Akt信號通路可以成為潛在的靶向治療策略。在腫瘤細胞中，TLR4與配體的結合可以激活下游PI3K/Akt途徑，上調IRAK-4表達，促進血管內皮生長因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，導致腫瘤形成[16]。Hsu等[10]的研究顯示，在結腸癌細胞中使用LPS激活TLR4信號傳導通路可以促進整合素β1介導的結腸癌細胞的黏附和肝轉移，用LPS刺激TLR4/MD2復合體可以激活PI3K/Akt信號通路，從而促進下游的整合素β1的功能，由此增加結腸癌細胞的黏附性和轉移的能力。包含β1亞單位的整合素主要是介導細胞與細胞外基質成分之間的黏附，故整合素β1表達增加可以促進腫瘤細胞的黏附能力，進一步促進腫瘤細胞的侵襲和遷移。

綜上所述，在宮頸癌細胞中，下調HMGB1表達可使TLR4下游信號傳導通路分子的表達下調或上調，最終導致SiHa細胞的侵襲和遷移能力下降，說明HMGB1可以通過激活TLR4的兩條通路，增強宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力。HMGB1以及TLR4/NF-кB、TLR4/PI3K/Akt信號傳導通路分子，尤其是其中起著關鍵作用的HMGB1和TLR4，可以作為未來宮頸癌靶向治療的研究對象。