嗎啡對非小細胞肺癌A549細胞增殖、侵襲、遷移及上皮間質轉化的影響

文懷昌，汪懿，金孝岠，楊柳，袁益民

(皖南醫學院第一附屬醫院，安徽蕪湖241000)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和致死率均位居惡性腫瘤首位。大部分肺癌患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳的手術時機。肺癌晚期患者多數會伴有不同程度的癌性疼痛，口服阿片類鎮痛藥是緩解疼痛的最基本方法。嗎啡作為阿片類鎮痛藥的代表性藥物，廣泛用于癌性疼痛的治療[1]。研究發現，嗎啡除強大的鎮痛作用外，還可調節多種腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉移，進而影響腫瘤患者的預后[2]。Niu等[3]研究發現，嗎啡具有促進乳腺癌細胞上皮間質轉化(EMT)的作用。但嗎啡對非小細胞肺癌(NSCLC)細胞增殖、遷移、侵襲及EMT的影響少見報道。2016年8月～2017年12月，我們采用嗎啡處理NSCLC細胞，觀察嗎啡對細胞增殖、遷移、侵襲及EMT相關分子標志物上皮細胞標志物E型鈣黏蛋白(E-cadherin)、間充質細胞標志物N型鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表達的影響，并探討其可能的作用機制，旨在為嗎啡的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 NSCLC細胞株A549由皖南醫學院中心實驗室提供。胎牛血清購自美國Gibco公司，RPMI1640培養基購自美國Hyclone公司，鹽酸嗎啡注射液購自東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司。

1.2 細胞培養方法與分組 向A549細胞中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。將細胞隨機分為對照組、1 μg/mL嗎啡組、10 μg/mL嗎啡組、100 μg/mL嗎啡組。

1.3 細胞增殖率檢測 采用CCK-8法。取對數生長期細胞，加入胰酶消化，制成單細胞懸液，調整細胞密度為2×104/mL，按2×103/孔接種于96孔板中。將96孔板放入37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中孵育過夜。吸棄舊培養基，1、10、100 μg/mL嗎啡組分別加入嗎啡濃度為1、10、100 μg/mL的完全培養基，對照組不加藥，每組設5個復孔，繼續培養24 h。加入10 μL的CCK-8溶液培養1 h，在酶標儀下讀取490 nm處的吸光值。細胞增殖率=給藥組吸光值/對照組吸光值×100%。

1.3 細胞遷移能力觀察 采用劃痕實驗。取對數生長期細胞，胰酶消化后制備單細胞懸液，按1×105/孔接種于6孔板，培養過夜。吸棄舊培養液，用10 μL槍頭垂直于6孔板背后劃痕，PBS沖洗。1、10、100 μg/mL嗎啡組分別加入嗎啡濃度為1、10、100 μg/mL的完全培養基，對照組不加藥。即刻在顯微鏡下拍照，記錄為0 h，繼續培養24 h后取出拍照，觀察劃痕愈合情況，以SPSS19.0軟件計算劃痕面積。劃痕愈合率=(0 h時劃痕面積-24 h劃痕面積))/0 h時劃痕面積×100%。

1.4 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實驗。將Matrigel基質膠與無血清培養基按1∶8稀釋，取50 μL包被小室底部膜的上室面，37 ℃孵育過夜。加入無血清培養基，放入溫箱中水化30 min。1、10、100 μg/mL嗎啡組分別加入嗎啡濃度為1、10、100 μg/mL的完全培養基，對照組不加藥。培養24 h后，胰酶消化細胞，用無血清培養基重懸，調整細胞密度至2.5×105/mL。每孔上室加入200 μL單細胞懸液，下室加入600 μL含10% FBS培養基，將小室放入恒溫培養箱培養24 h。拭去Transwell膜上室內的細胞，甲醛固定15 min，結晶紫染色10 min。用流動的水沖洗去多余的結晶紫，晾干后，倒置顯微鏡下拍照。每個小室隨機選取5個視野，拍照并計數細胞數量。

1.5 細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取對數生長期細胞，按1×105/孔接種于6孔板。待細胞貼壁后，1、10、100 μg/mL嗎啡組分別更換嗎啡濃度為1、10、100 μg/mL的完全培養基，對照組更換正常培養基，繼續培養24 h。取各組細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣于制好的SDS-PAGE上，電泳后轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉l h，加入稀釋的一抗(E-cadherin抗體1∶1 000，Vimentin抗體1∶1 000，GAPDH抗體1∶1 000),4 ℃搖床過夜。次日加入含有2%脫脂奶粉-TBST稀釋的二抗(1∶5 000)，室溫搖床孵育1 h。TBST洗滌后，加入顯影劑，凝膠成像系統中觀察、拍照。以GAPDH蛋白表達作為內參，采用Image J軟件分析目的條帶的灰度值。

2 結果

2.1 各組細胞增殖率比較 對照組和1、10、100 μg/mL嗎啡組的細胞增殖率分別為100%、87.90%±3.23%、78.36%±3.56%、41.97%±1.71%，嗎啡組細胞增殖率均低于對照組，100 μg/mL嗎啡組低于1、10 μg/mL嗎啡組(P均<0.05)。

2.2 各組劃痕愈合率比較 對照組和1、10、100 μg/mL嗎啡組的劃痕愈合率分別為82.27%±4.56%、66.71%±3.57%、48.10%±2.81%、30.42%±7.13%。嗎啡組劃痕愈合率低于對照組，100 μg/mL嗎啡組低于1、10 μg/mL嗎啡組(P均<0.05)。

2.3 各組穿膜細胞數比較 對照組和1、10、100 μg/mL嗎啡組的穿膜細胞數分別為(83.6±3.0)、(68.4±5.6)、(43.2±5.8)、(29.0±6.7)個。嗎啡組穿膜細胞數較對照組減少，100 μg/mL嗎啡組少于1、10 μg/mL嗎啡組(P均<0.05)。

2.4 各組細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達比較 見表1。與對照組相比，嗎啡組E-cadherin蛋白表達升高，N-cadherin、Vimentin蛋白表達降低(P均<0.05)。

表1 各組細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

NSCLC患者的5年生存率僅10%～15%，腫瘤復發及轉移是導致治療失敗和患者死亡的最主要原因。腫瘤細胞的遷移、侵襲能力越強，其形成轉移瘤的能力就越強，所以針對腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力的研究成為目前研究的熱點。關于阿片類鎮痛藥對腫瘤增殖、遷移和侵襲能力的影響目前尚無一致的結論。多項體外細胞實驗和動物實驗研究認為，嗎啡可通過多種機制促進或抑制腫瘤增殖、遷移。Bimonte等[4]研究發現，單次或者低劑量應用阿片類鎮痛藥可促進腫瘤增殖、遷移，而長期大劑量應用阿片類鎮痛藥可抑制腫瘤的進展。Tegeder等[5]研究顯示，當嗎啡劑量大于10 μmol/L時可抑制腫瘤細胞的增殖。我們推測，導致研究結果差異性的原因可能與研究方法、給藥方式、阿片類鎮痛藥種類、劑量以及血藥濃度不同有關。本研究結果顯示，1、10、100 μg/mL嗎啡組細胞增殖率均低于對照組，100 μg/mL嗎啡組低于1、10 μg/mL嗎啡組，表明1、10、100 μg/mL嗎啡均能夠抑制A549細胞增殖，100 μg/mL嗎啡的抑制作用最強。

侵襲和轉移能力是惡性腫瘤的重要生物學特性，大多數NSCLC患者都是由于晚期腫瘤在體內進行了擴散轉移而最終導致死亡，也是其放化療效果不佳的原因之一[6]。而腫瘤的轉移能力表現在其遷移力和侵襲力。本研究結果顯示，嗎啡組劃痕愈合率和穿膜細胞數均低于對照組，100 μg/mL嗎啡組低于1、10 μg/mL嗎啡組，表明1、10、100 μg/mL嗎啡均可抑制A549細胞的體外遷移和侵襲能力，100 μg/mL嗎啡的抑制作用最強。

EMT是指上皮細胞在某些生理或病理情況下，上皮細胞極性丟失，逐漸轉化為間充質細胞的生物學過程。EMT參與人體的多種生理和病理過程，如胚胎發育和器官形成、組織修復與器官纖維化、腫瘤的侵襲和轉移等。EMT是腫瘤侵襲、轉移過程及腫瘤產生耐藥性的關鍵步驟，腫瘤的惡性程度直接由腫瘤細胞EMT的程度所決定[7，8]。E-cadherin是一種細胞膜黏附蛋白，對上皮細胞極性及上皮完整性的維持起關鍵作用[9]。生理條件下，E-cadherin蛋白可調節細胞與基質之間、細胞與細胞之間的黏附，維持細胞結構的穩定性和完整性[10]。當Ecadherin蛋白表達下調發生在惡性腫瘤細胞中時，細胞極性會完全消失，從而使腫瘤細胞獲得侵襲轉移的能力[11]。研究發現，NSCLC的TNM分期、惡性程度、轉移性及患者預后與E-cadherin蛋白的低表達具有明顯的相關性[12]。作為細胞骨架蛋白之一，Vimentin是一種特異性的表達于間質細胞的中間微絲蛋白，在上皮細胞通常不表達[13]。當腫瘤細胞中出現Vimentin蛋白的表達上調時，則提示其由上皮細胞表型轉變為間質細胞表型[14]。有研究發現，Vimentin在NSCLC中的表達與腫瘤細胞的分化程度、侵襲和轉移明顯相關，可作為評估NSCLC患者預后的一個重要指標[15，16]。Koodie等[17]報道，嗎啡可通過上調E-cadherin蛋白、下調Vimentin蛋白的表達阻止肺癌細胞EMT的發生，從而抑制腫瘤的增殖、侵襲轉移。而Lennon等[2]報道，采用1、10、100 nmol/L嗎啡處理非小細胞肺癌A549細胞后，嗎啡通過作用于μ型阿片受體上調Vimentin蛋白的表達，促進了腫瘤的增殖、侵襲轉移。本研究結果顯示，1、10、100 μg/mL嗎啡處理A549細胞后，能使上皮細胞標志物E-cadherin蛋白表達上調，并下調間充質細胞標志物Vimentin蛋白、N-cadherin表達水平，說明嗎啡能有效抑制NSCLC的EMT相關蛋白表達。

綜上所述，嗎啡能夠抑制A549細胞增殖、侵襲與轉移，從而抑制惡性腫瘤的發生進展，其機制可能與抑制EMT有關。目前關于嗎啡對腫瘤細胞生物學行為影響的研究結果仍不一致，需要更系統、科學的體外細胞實驗、動物及臨床研究等進一步闡明。