姜黃素干預的人結腸癌耐藥細胞蛋白質組學分析

李雷，陳軍，李賀，崔希剛，欒曉鵬，張宇，魯科翔，曹先圣，畢濤，尹高平

(濱州醫學院煙臺附屬醫院，山東煙臺264000)

結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前結腸癌的治療以手術為主、輔以放化療，化療對中晚期結腸癌有著非常重要的作用，但腫瘤細胞對化療藥物的多藥耐藥常導致化療失敗。因此，尋找與結腸癌多藥耐藥相關的蛋白質，對提高結腸癌治療效果具有重要意義。我們的前期研究發現，姜黃素可通過下調多藥耐藥基因1(MDR1)、P-糖蛋白(P-gp)、凋亡抑制基因(survivin)蛋白表達，誘導腫瘤細胞凋亡等多種途徑在體內和體外逆轉腫瘤的多藥耐藥[2，3]。但姜黃素逆轉腫瘤耐藥的機制非常復雜，因此，有必要采用新技術和新方法來研究其逆轉腫瘤耐藥的機制。2017年1～12月，我們利用蛋白質組學技術，對比姜黃素處理和未經姜黃素處理的人結腸癌耐藥細胞HCT-8/VCR之間差異表達的蛋白，尋找與姜黃素逆轉結腸癌耐藥相關的蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌耐長春新堿(VCR)細胞系HCT-8/VCR購自上海潤成生物科技有限公司。胎牛血清及RPMI1640培養基購自Gibico公司，兩性電解質(Bio-Lyte pH 3～10)、IPG干膠條(非線性pH 3～10，17 cm)、四甲基乙二胺(TEMED)、尿素(Urea)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)購自美國BIO-RAD公司，VCR購自深圳萬樂藥業有限公司，姜黃素購自Sigma公司，三羥甲基氨基甲烷(Tris)、DNA酶、RNA酶、丙烯酰胺、碘乙酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)、甲叉雙丙烯酰胺、PMSF、Bradford蛋白定量檢測試劑盒購自上海生工生物工程公司，其他化學試劑均為國產分析純。Protean ⅡⅪ Cell型垂直電泳系統及附件、PDQuest 8.0圖像分析軟件Protean IEF Cell型等電聚焦儀及附件、GS-800掃描儀、ChimiDox-XRS凝膠成像儀均為BIO-RAD公司產品。

1.2 細胞培養、分組及處理 向HCT-8/VCR細胞中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，用0.25%胰酶在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下進行消化傳代培養。將2 000 ng/mL VCR加入培養液中來維持細胞的耐藥性，實驗前1周撤藥培養。取10瓶處于對數生長期的細胞，每瓶細胞大約70%融合。隨機選取5瓶作為觀察組，加入終濃度為25 μmol/L的姜黃素，另外5瓶作為對照組，加入等體積生理鹽水，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下作用24 h。

1.3 總蛋白質提取 取兩組對數生長期細胞，PBS洗滌，離心，收集細胞到EP管中。加入1 mmol/L EDTA和1 mmol/L苯甲基磺酰(PMSF)，漩渦振蕩，在液氮中反復凍融3～4次；加入 5 μg/mL RNaseA和20 μg/mL DNase Ⅰ，4 ℃下作用30 min；加入細胞裂解液，4 ℃下作用30 min，每隔10 min振蕩1次；離心收集上清，采用Bradford法測定提取液中的蛋白質濃度。分裝樣品，-80 ℃保存備用。

1.4 蛋白質的分離 采用固相pH梯度雙向凝膠電泳，以固相pH梯度等電聚焦為第一向，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)為第二向(2-DE)。取總蛋白質為200 μg的樣品上樣，進行等電聚焦(IEF)電泳，經沖洗和平衡后，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離蛋白質。

1.5 蛋白質顯色 用去離子水漂洗SDS-PAGE膠，加入甲醇、冰醋酸固定。加入30%甲醇、3.14‰硫代硫酸鈉、6.8%無水乙酸鈉敏化30 min，2.5‰硝酸銀染色20 min。去離子水漂洗，加入2.5%碳酸鈉、0.04‰甲醛顯影至蛋白質點清晰。加入EDTA終止反應，最后用10%甘油保存備用。

1.6 差異表達蛋白點的篩選 染色后的凝膠用Bio-Rad公司的GS-800掃描儀掃描后獲得蛋白質點圖譜，應用PDQuest8.0軟件進行電泳圖譜圖像分析，圖像分析過程包括蛋白點的檢測、匹配、背景消減、量化和ID校正等，對數據進行分析，最后生成數據分析報告。分別對觀察組和對照組的2-DE圖譜進行重復性檢測，然后對2-DE圖譜的蛋白點進行差異分析，差異蛋白點的判斷標準：一是肉眼鑒別有與無的差別，二是圖像分析軟件標記的灰度值相差2倍以上。數據分析在SPSS10.0統計軟件和Excel上進行。

1.7 差異表達蛋白的篩選與鑒定 采用質譜及生物信息學分析法。選取差異蛋白點，進行脫色、脫水、還原、酶解、萃取、離心、脫鹽，基質液與樣品充分混合，自然風干后采用MALDI-TOF-MS系統進行質譜分析，獲得肽質量指紋圖，采用Mascot軟件(http://www.matrixscience.com)進行數據庫搜索，確定各點所屬的蛋白，以Profound為搜索軟件，采用Mascot Distiller對肽質量指紋圖譜(PMF)原始質譜峰進行去同位素處理并過濾肽質量峰，篩選出差異蛋白質。排除未檢測出蛋白質或檢測出重復蛋白質的差異蛋白。結合雙向凝膠電泳相應蛋白質點的氨基酸序列及分子量、表觀等電點、匹配率、亞細胞定位以及得分情況進行蛋白質鑒定。

2 結果

2.1 差異表達蛋白點篩選結果 獲得重復性較好、分辨率較高的HCT-8/VCR細胞雙向電泳圖譜。在相同的參數設置和實驗條件下對兩組樣品進行3次雙向電泳，發現觀察組和對照組細胞凝膠的蛋白點數分別為1 030±69、1 070±96，匹配率為85.6%。比較兩組細胞的2-DE圖譜，并用PDQuest 8.0軟件進行圖像分析,按2倍的表達量計算，識別了29個差異表達的蛋白點。

2.2 差異表達蛋白的鑒定結果 共篩選并鑒定出兩組差異表達的蛋白10種，其中在對照組高表達的有7種，分別是谷胱甘肽S轉移酶P1(GSTP1)、重組人FK506結合蛋白4(FKBP4)、X線修復交叉互補基因5(XRCC5)、腫瘤蛋白翻譯調節因子1(TPT1)、熱休克蛋白8(HSPA8)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、前列腺特異性膜抗原剪接變體(PSMA5)；在觀察組中高表達的有3種，分別是肽基脯氨酰順反異構酶(PPIB)、鳥氨酸轉氨酶(OAT)、核內不均一核糖核蛋白H1(HNRNPH1)。見表1。

表1 兩組差異表達蛋白質的相關信息

3 討論

腫瘤細胞的多藥耐藥是導致化療失敗的主要因素。腫瘤多藥耐藥形成的機制十分復雜，可能與以下因素有關：①DNA拓撲異構酶活性下降及谷胱甘肽-S轉移酶、蛋白激酶C系統活性升高；②肺耐藥相關蛋白對化療藥物的外排、P-gP的過度表達及多藥耐藥相關蛋白導致的耐藥；③bax、Fas等凋亡基因的降低及突變型p53、bcl-2等抗凋亡基因的高表達也是抑制腫瘤細胞凋亡，導致腫瘤耐藥的重要原因。藥物逆轉腫瘤多藥耐藥是提高化療藥物敏感性的重要手段，但目前許多逆轉劑如環孢素A、維拉帕米等具有明顯的不良反應，在臨床上的應用受到限制。姜黃素具有不良反應少、調節和提高機體的免疫功能、作用靶點較多、長期應用無明顯不良反應、能逆轉腫瘤多藥耐藥等優點。我們前期的研究發現，25 μmol/L的姜黃素作用于人結腸癌耐藥細胞HCT-8/VCR 24 h時，增強了HCT-8/VCR細胞對VCR的敏感性，抑制了多藥耐藥基因MDR1 mRNA及蛋白表達，提高了細胞對化療藥物的敏感性，從而逆轉結腸癌細胞的多藥耐藥[2，3]。但姜黃素逆轉腫瘤耐藥的機制非常復雜，因此，有必要采用新技術和新方法來研究其逆轉腫瘤耐藥的機制。

目前，蛋白質組學技術已被廣泛用于發現腫瘤的標志物、評價藥物療效、尋找新的藥物治療靶點等方面。蛋白質組學是從整體角度來研究細胞的功能、生化生理過程及其活動規律，通過對細胞全蛋白特性進行大范圍研究，包括蛋白間相互作用、蛋白表達水平和轉錄后修飾等方面，以期在蛋白水平上對細胞活動、網絡聯系以及疾病過程等獲得全面認識。本研究利用2-DE聯合質譜技術，從蛋白質組學角度研究姜黃素逆轉人結腸癌HCT-8/VCR細胞多藥耐藥機制，尋找與結腸癌多藥耐藥密切相關的蛋白。

本研究通過雙向凝膠電泳技術，成功獲得了分辨率較高、背景清晰、重復性較好的HCT-8/VCR細胞系2-DE圖譜，通過對雙向電泳圖譜的分析發現觀察組和對照組共有29個差異蛋白點。對29個差異蛋白點進行鑒定和生物信息學分析，共鑒定出了10種蛋白，其中7種在對照組高表達，分別是GSTP1、FKBP4、XRCC5、TPT1、HSPA8、SOD1、PSMA5，3種在觀察組高表達，分別是PPIB、OAT、HNRNPH1。這些差異表達的蛋白主要涉及信號傳導、腫瘤細胞的分裂、多藥耐藥以及抗氧化、凋亡和糖酵解，與結腸癌的多藥耐藥密切相關。

GSTs是Ⅱ相代謝酶，其包括α(GSTA)、π(GSTP)、μ(GSTM)、θ(GSTT)4種類型。多種癌癥的遺傳易感性與其基因多態性相關，如乳腺癌、腸癌、胃癌等[4～6]。GSTP1是GSTs家族的主要成員，能催化多種親電子物質如致癌物、藥物與還原型谷胱甘肽結合，形成易溶于水的物質排出體外；其與親脂性藥物結合增強其水溶性，促進藥物排泄，降低藥物療效。Tozawa等[7]對胃癌耐藥細胞株(MKN45/CDDP)進行研究，發現GSTP1 mRNA水平與順鉑的耐藥相關。Wu等[8]報道，肺癌耐藥細胞株H446/CDDP被含有Fas的腺病毒轉染，通過RT-PCR、Western blotting分析，超表達的Fas能逆轉耐藥細胞H446/CDDP的耐藥性，其機制可能是由于Fas通過減少GSTP1和ERCC1的表達從而使細胞對凋亡的敏感性增加，以此來逆轉腫瘤耐藥。本研究中，觀察組GSTP1出現了明顯的下調，姜黃素對HCT-8/VCR細胞GSTP1蛋白的下調可能使得機體對腫瘤化療藥物的解毒性下降，療效增強，從而逆轉腫瘤的多藥耐藥。

XRCC是參與DNA損傷修復的一組重要基因，至今已鑒定出11種不同的遺傳族群。其中XRCC5為重要的雙鏈斷裂損傷修復基因，DNA修復能力對化療藥物的療效具有重要影響，如果腫瘤細胞DNA修復能力強，則化療藥物對此類細胞的療效差[9]。Yadav等[10]研究顯示，XRCC1能影響頭頸癌細胞對化療和放療的敏感性。任振義等[11]研究顯示，XRCC5基因被抑制可增強A549肺癌細胞對放射線的敏感性。本研究中，XRCC5在觀察組出現了明顯的下調，提示姜黃素可能通過抑制XRCC5基因的表達，從而影響腫瘤細胞DNA的修復來逆轉腫瘤的多藥耐藥，其具體機制有待進一步研究。

TPT1是一種與腫瘤生長相關的蛋白，TPT1具有調節細胞周期的進程、惡性轉移、細胞外組胺釋放因子及細胞增殖和凋亡等作用，其在胰腺癌[12]、肝癌[13]等腫瘤細胞中強烈表達，阻斷該蛋白可使腫瘤細胞的惡性表型被抑制。Amson等[14]研究發現，TPTl使腫瘤細胞對放、化療耐受可能是通過調節P53-MDM2-Numb通路來實現的，以此為治療靶點有可能增加腫瘤對放化療的敏感性。

熱休克蛋白(HSP)是一類具有高度保守的氨基酸序列及其編碼基因的蛋白質，其中HSPA8是主要的伴侶蛋白之一。研究發現，HSP與腫瘤細胞耐藥性的發生及腫瘤的預后有密切關系。Guttmann等[15]研究發現，下調HSP表達可使癌細胞對放化療的敏感性增加。Chauhan等[16]對宮頸癌和卵巢癌細胞進行研究，結果顯示紫杉醇通過抑制HSP27的表達來逆轉腫瘤細胞耐藥性。還有研究顯示，HSP70抑制物DSG能夠抑制白血病原始細胞的增殖，同時降低惡性干細胞和原始細胞對化療藥物的抵抗性[17]。本研究顯示，觀察組HSPA8明顯下調，提示姜黃素可能通過抑制HSPA8基因的表達來逆轉腫瘤細胞的耐藥性。

SOD是抗氧化酶家族成員，其在人體內有3種形式，即SOD1(細胞內CuZn SOD)、SOD2(線粒體中Mn SOD)和SOD3(細胞外CuZn EC-SOD)。SOD具有防治腫瘤、抗衰老、防輻射等作用[18～20]。Zhu等[21]對小鼠前列腺癌細胞RM-1進行研究，結果顯示，通過RNA干擾RelB基因可以提高RM-1對放療的敏感性，其機制可能與抑制SOD表達、誘導細胞凋亡有關。另有報道，正常組織中SOD活性較癌組織中高，抑制SOD后藥物及射線對癌細胞的毒性更強，更易殺傷癌細胞，從而提高對放化療的有效性。本研究顯示，觀察組SOD1明顯下調，提示姜黃素可能通過抑制SOD1基因的表達來提高腫瘤細胞對放化療的有效性。

PSMA是前列腺疾病診斷、治療的潛在靶點。有資料表明，在PSMA基因轉錄過程中可通過多種剪接方式形成多種不同的剪接變異體，PSMA5就是從前列腺組織中克隆出的一種新的剪接變異體。目前，尚無文獻報道其在結腸癌耐藥細胞中表達。本研究顯示，觀察組PSMA5表達較對照組降低，其機制是我們下一步研究的方向。

FKBP4在對照組中高表達，PPIB、OAT、HNRNPH1在觀察組中高表達，這4種蛋白在姜黃素逆轉結腸癌耐藥細胞中發病的作用需要進一步研究。總之，本研究從蛋白質整體水平來研究姜黃素逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性的產生機制、篩選耐藥相關的蛋白分子，有可能找到在姜黃素逆轉結腸癌多藥耐藥作用機制中相關的蛋白，并進一步分析其功能，為深入研究其機制提供實驗依據。