PI3K/Akt通路在肝癌細胞遷移和侵襲中的作用

曹煜姍，孫達權(quán)，夏慶，彭明兵，徐國強

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550025)

原發(fā)性肝癌(HCC)是一種惡性程度高、進展快、預(yù)后差的惡性腫瘤[1]。肝癌的術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是患者不能長期生存的主要原因。分子靶向藥物治療在控制HCC的腫瘤增殖、延緩復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及提高患者的生活質(zhì)量等方面具有獨特的優(yōu)勢[2]。已知肝癌的發(fā)病機制中存在著多個關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，是進行分子靶向治療的理論基礎(chǔ)和重要的潛在靶點[3]。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有調(diào)控細胞增殖與凋亡的作用，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。3-磷酸肌醇-依賴性激酶1(PDK1)、10號染色體上的磷酸酶和張力蛋白同源蛋白(PTEN)、Akt是PI3K/Akt信號通路的重要基因。Akt是PI3K/Akt信號通路中的原癌基因[5]，PDK1是PI3K/Akt途徑中重要的信號分子，PDK1是Akt的上游基因，PDK1可以通過PI3K/Akt信號通路，調(diào)節(jié)細胞的一系列生物學(xué)反應(yīng)，而活化的Akt可以調(diào)節(jié)其下游的多條路徑，從而促進細胞增殖、生長、抗凋亡以及遷移[6]。PTEN是一種抑癌基因，可以直接抑制Akt的活性。2016年6月～2018年1月，我們以肝癌細胞為研究對象，通過加入化學(xué)抑制劑和激動劑的方式，抑制或促進PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達，探討PDK1、PTEN、Akt基因在肝癌細胞遷移、侵襲中的作用，為肝癌的靶向治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌SMMC-7721細胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone公司，新生牛血清(FBS)購于四季青公司，二甲基亞砜(DMSO)購于Sigma公司，PVDF膜購自Millipore公司，Transwell小室購自Corning公司，兔抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Akt抗體購自Cell Signaling Technology公司(1∶1 000稀釋)，PTEN抗體購于Abcam公司(1∶500稀釋)，Phospho-Akt、Phospho-PTEN、PDK1(Phospho-Tyr376)抗體購自Affinity公司，GAPDH抗體系單克隆抗體購自Proteintech公司，Akt特異性激動劑SC79、PTEN特異性抑制劑VO-OHpic、PDK1特異性抑制劑OSU03012購于MCE公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組處理 將SMMC-7721細胞加入RPMI-1640培養(yǎng)基+15% FBS+1%青鏈霉素，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)至融合80%左右，用于后續(xù)實驗。將細胞分為對照組、HSC-CM組、PDK1抑制劑組、Akt激動劑組、PTEN抑制劑組。對照組加入RPMI-1640培養(yǎng)基，HSC-CM組加入HSC-CM，PDK1抑制劑組加入OSU03012(終濃度0.3 μmol/L)，Akt激動劑組加入SC79(終濃度0.02 μmol/L)，PTEN抑制劑組加入VO-Ohpic(終濃度0.33 μmol/L)，各組細胞培養(yǎng)24 h后收集。

1.3 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。取各組細胞消化計數(shù)，按2×106/孔鋪到6孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。12 h后細胞完全長滿，用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓細胞12 h。使用20 μL的加樣槍頭，沿6孔板的刻度井字劃痕。PBS洗去懸浮的細胞，加入新鮮的含1%血清的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。分別于0、72 h顯微鏡下拍照，觀察各組細胞的遷移情況并測量劃痕的寬度，計算細胞遷移率。細胞遷移率=(0 h劃痕寬度-72 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.4 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實驗。以1∶36的比例用RPMI-1640稀釋Matrigel膠，取100 μL加入小室上室，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育3 h。取各組細胞，加入胰蛋白酶消化，制成細胞密度為1×106/mL的細胞懸液，取200 μL接種于小室上層。下室加入含15% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室，甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。雙蒸水沖洗，用棉簽去除上室表面細胞，待膜干后在倒置顯微鏡下觀察。每組細胞隨機計數(shù)5個視野，統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)，實驗重復(fù)3次取平均值。

1.5 PDK1基因相關(guān)蛋白PDK1、p-PDK1、Vimentin、E-cadherin及PTEN、Akt蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細胞，加入RIPA細胞裂解液，冰上孵育10 min，充分裂解細胞提取總蛋白，采用BCA試劑盒對細胞總蛋白進行定量。SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，以TBST緩沖液洗膜3次；加入一抗稀釋液室溫雜交3 h或4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗膜3次，加入相應(yīng)的帶有HRP發(fā)光基團的二抗室溫孵育2 h。使用蛋白質(zhì)印跡法分析蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞遷移能力比較 對照組、PDK1抑制劑組、Akt激動劑組、PTEN抑制劑組的細胞遷移率分別為40.9%±9.28%、38.33%±8.54%、61.48%±4.89%、51.36%±4.7%。與對照組比較，PDK1抑制劑組細胞遷移率減少，Akt激動劑組細胞遷移率增加，PTEN抑制劑組細胞遷移率增加(P<0.05或<0.01)。

2.2 各組細胞侵襲能力比較 對照組、PDK1抑制劑組、Akt激動劑組、PTEN抑制劑組的穿膜細胞數(shù)分別為(12±1)、(8±2)、(46±3)、(31±1)個。與對照組比較，PDK1抑制劑組穿膜細胞數(shù)減少，Akt激動劑組穿膜細胞數(shù)增加，PTEN抑制劑組穿膜細胞數(shù)增加(P均<0.01)。

2.3 各組PDK1、p-PDK1、Vimentin、E-cadherin及PTEN、Akt蛋白表達水平比較 見表1。與對照組比較，PDK1抑制劑組PDK1、p-PDK1表達降低，E-cadherin表達升高，Vimentin表達降低；Akt激動劑組Akt表達升高，PTEN表達降低；PTEN抑制劑組Akt表達升高，PTEN表達降低(P<0.05或<0.01)。

表1 各組PDK1、p-PDK1、Vimentin、E-cadherin、PTEN、Akt表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

HCC是肝癌最常見的類型，在所有肝癌中占80%。HCC術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的比例非常高，導(dǎo)致肝癌患者總體臨床預(yù)后較差。化療栓塞術(shù)可改善不能手術(shù)切除的HCC患者的生存率，然而許多患者合并晚期并發(fā)癥，5年存活率僅5%[7]，因此急需尋找更有效的治療方法。分子靶向治療作為一種新型治療腫瘤的方式，主要是針對肝癌發(fā)生微環(huán)境中特殊的分子異常，作用于肝癌發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用的靶分子和其調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為肝癌的治療開辟了新局面。目前針對肝癌的分子靶向藥物如索拉非尼、Brivanib已經(jīng)應(yīng)用于臨床，但是缺乏特異性較高的肝癌分子靶向藥物，目前大部分靶向肝癌相關(guān)信號通路的治療藥物存在有效率低、價格高昂、靶點選擇性不高、高耐藥性的缺點，療效不甚理想。在肝癌治療方面，目前有深入研究的幾種經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括Wnt/β-catenin信號通路、Hedgehog信號通路，對于PI3K/Akt信號通路和肝癌的關(guān)系國內(nèi)外報道較少。

研究顯示，PI3K/Akt信號通路失調(diào)見于多種人類疾病，包括癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)疾病[8]，人類腫瘤中PTEN常發(fā)生突變或缺失。Akt是PI3K/Akt信號通路中的原癌基因[9]，PDK1是PI3K/Akt途徑中重要的信號分子，PDK1是Akt的上游基因，對Akt和其他PI3K/Akt下游激酶的活性進行調(diào)節(jié)，也就是說，PDK1可以通過PI3K/Akt信號通路，調(diào)節(jié)細胞的一系列生物學(xué)反應(yīng)，而活化的Akt可以調(diào)節(jié)其下游的多條路徑，從而促進細胞增殖、生長、抗凋亡以及遷移[10]。PTEN是一種抑癌基因，可以通過去磷酸化的三磷酸磷脂酰肌醇抑制Akt活性。而激活PI3K/Akt信號通路之后，可以引起一系列的反應(yīng)，包括促進細胞的生長、增殖，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)以及血管的生成[11]。蛋白質(zhì)磷酸化/去磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最重要的、最普遍的形式，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究中有重要意義[12，13]。EMT是極化上皮細胞經(jīng)歷多種生化改變以呈現(xiàn)間充質(zhì)表型的過程[14]。在惡性腫瘤進展過程中，上皮細胞常常失去其高度分化的表型，變成成纖維細胞樣或間充質(zhì)表型。該過程涉及細胞間黏附和細胞間連接的損失、基底膜的破壞、肌動蛋白細胞骨架的重組、增強的遷移能力和侵襲力、轉(zhuǎn)錄因子的激活以及上皮標志物的下調(diào)和間充質(zhì)基因的表達[15]。EMT的分子和形態(tài)特征通常與組織學(xué)分化差、組織完整性破壞相關(guān)，并且一般與疾病的進展和組織功能的惡化有關(guān)[11]。肝細胞癌是一種上皮源性腫瘤，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是肝癌治療過程中的主要障礙。研究表明，EMT與肝癌侵襲、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及低存活率密切相關(guān)[13]。本研究以SMMC-7721細胞作為模型細胞，觀察PI3K/Akt信號通路中PDK1、Akt、PTEN在肝癌細胞遷移、侵襲和蛋白表達中的作用。結(jié)果顯示，OSU03012下調(diào)了原癌基因PDK1，抑制了肝癌細胞SMMC-7721的遷移和侵襲；化學(xué)激動劑SC79上調(diào)了原癌基因Akt的蛋白表達，化學(xué)抑制劑VO-Ohpic抑制了抑癌基因PTEN的蛋白表達活性，兩者均可以促進肝癌細胞的遷移和侵襲。也就是說，抑制PTEN與促進Akt產(chǎn)生的效應(yīng)相同。以上研究均說明了PI3K/Akt信號通路在肝癌中的作用機制。

異常的磷酸化作用會引起異常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，觀察基因?qū)Ω伟┘毎姿峄挠绊憣τ谶M一步研究PI3K/Akt通路與肝癌之間的關(guān)系有重要意義[16]。本研究同時觀察了PDK1基因在磷酸化水平上的蛋白表達，對于深入了解該信號通路在肝癌中的作用有重要意義。在本研究中，采用PDK1抑制劑的方法抑制PDK1蛋白表達，觀察到p-PDK1表達降低，與PDK1的變化趨勢一致；EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達減低，而Vimentin表達增高。有研究表明，E-cadherin表達下調(diào)可以啟動細胞的EMT，而N-cadherin表達增加與EMT呈正比[16]。說明在肝癌中如果PDK1蛋白表達下調(diào)，則肝癌細胞EMT水平也會下調(diào)。

綜上所述，抑制PI3K/Akt信號通路中PDK1表達可以抑制肝癌細胞遷移和侵襲，并抑制肝癌細胞的EMT水平；促進Akt和抑制PTEN表達可以促進肝癌細胞遷移和侵襲。由此推測PDK1、Akt、PTEN三個基因在肝癌發(fā)展中起到一定作用，為肝癌的靶向治療提供了潛在的靶點。