七氟醚不同麻醉時間對大鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制

羅思琴，方開云，蔣向平，剛紹鵬，何祥，蔣玲

(1貴州省人民醫(yī)院，貴陽550002；2貴州醫(yī)科大學(xué))

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是術(shù)后出現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)以記憶和集中力損害為主，可以持續(xù)數(shù)周至數(shù)年。有研究發(fā)現(xiàn)，麻醉是POCD發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。七氟醚廣泛應(yīng)用于臨床，然而關(guān)于七氟醚麻醉對認(rèn)知功能影響的研究結(jié)果各不相同。動物實(shí)驗(yàn)顯示，新生大鼠、成年大鼠以及老年大鼠吸入七氟醚均可引起認(rèn)知功能損害[1～3]。我們的前期研究證實(shí)，吸入1%、3%、5%七氟醚1 h均可導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能損害，海馬神經(jīng)元α7乙酰膽堿受體(α7-nAchR)的表達(dá)下調(diào)[4]。有研究表明，七氟醚對認(rèn)知功能的影響與吸入濃度和時間相關(guān)[5]，而吸入相同濃度、不同時間七氟醚麻醉對成年大鼠認(rèn)知功能的影響，目前鮮有報(bào)道。2016年6月～2017年5月，我們觀察了吸入七氟醚不同時間對大鼠認(rèn)知功能及海馬神經(jīng)元α7-nAchR表達(dá)的影響，為POCD的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 3～4月齡SD大鼠96只，雌雄各半，體質(zhì)量220～270 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。七氟醚(Abbvie公司，美國)。Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，Ohmeda excel 110 SE型麻醉機(jī)(美國)，自動曝光儀(Bio-Rad，美國)，CFX ConnectTMReal-time PCR儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 動物分組與處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為七氟醚1、2、3組和對照組各24只。對照組吸入空氣，七氟醚1、2、3組分別吸入3%七氟醚1、3、5 h。麻醉方法：麻醉前禁食禁飲8 h，將大鼠置于60 cm×30 cm×25 cm的透明麻醉箱內(nèi)。麻醉箱有兩個側(cè)孔，一側(cè)孔連接麻醉機(jī)，用麻醉氣體揮發(fā)罐控制麻醉氣體輸出濃度；另一側(cè)孔連接氣體監(jiān)測儀監(jiān)測流出氣體中的七氟醚濃度。呼出七氟醚濃度維持在3%，調(diào)節(jié)氧流量為3 L/min。使用嬰兒脈搏氧飽和度探頭貼于大鼠腹部，監(jiān)測血氧飽和度，每隔1 h采集鼠尾動脈血樣，行血?dú)夥治觯躏柡投燃皠用}血?dú)夥治鼋Y(jié)果維持在正常范圍。對照組吸入空氣，其他處理同實(shí)驗(yàn)組。麻醉結(jié)束后將各組大鼠放回鼠籠，待其蘇醒1 h后進(jìn)飲食。

1.3 大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力觀察 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。用藥前行定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練各組大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。共訓(xùn)練5 d，4次/d，上午9：00～12：00進(jìn)行。將大鼠分別從4個象限入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)尋找到平臺的時間(逃避潛伏期)并讓大鼠在平臺上停留10 s，超過120 s未能找到平臺者，用木棒將其引上平臺并在平臺上停留10 s，其潛伏期計(jì)為120 s。每天4次測定結(jié)果的平均值作為逃避潛伏期。于第6天即麻醉前1 d進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，測試大鼠對平臺空間位置記憶的能力。撤去平臺，從目標(biāo)象限的對稱象限將大鼠面向槽壁放入水中，記錄120 s內(nèi)目標(biāo)象限持續(xù)時間、目標(biāo)象限路程、穿越平臺次數(shù)，計(jì)算原平臺所在象限時間占總時間比、原平臺所在象限路程占總路程比。于麻醉后1、7 d每組取12只大鼠進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。

1.4 海馬組織中α7-nAchR蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。于麻醉后1、7 d水迷宮實(shí)驗(yàn)后，各組分別取12只大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取一側(cè)海馬組織，勻漿，加入裂解液進(jìn)行研磨，離心取上清。采用BCA蛋白定量法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜，加入8%脫脂奶粉封閉。加入α7-nAchR單克隆抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜。加入HRP標(biāo)記抗大鼠IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。TBST洗滌，ECL發(fā)光液于自動曝光儀中進(jìn)行曝光。采用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，以α7-nAchR蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 海馬組織中α7-nAchR mRNA表達(dá)檢測 采用Real-time PCR法。取大鼠一側(cè)海馬組織勻漿，加入TRIzol液提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：α7-nAchR上游5′-ATGGTGGCAAAATGCCTAAG-3′，下游5′-CTCGGAAGCCAATGTAGAGC-3′，擴(kuò)增片段長度204 bp；β-actin上游5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′，擴(kuò)增片段長度207 bp。反應(yīng)體系：α7-nAchR上下游引物各0.5 μL，SYBR Green熒光染料5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL，總體系10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，使用熒光定量PCR儀采集待測基因及內(nèi)參的熒光信號，記錄Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算α7-nAchR mRNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 各組定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期均呈逐日縮短的趨勢。七氟醚1、2、3組與對照組比較，逃避潛伏期無明顯延長(P均>0.05)。見表1。

表1 各組逃避潛伏期比較

2.2 各組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 與對照組比較，七氟醚1、2、3組麻醉后1 d穿越原平臺次數(shù)、總路程差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，七氟醚1、2、3組麻醉后7 d穿越原平臺次數(shù)、總路程、目標(biāo)象限路程差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，七氟醚1、2、3組各時點(diǎn)目標(biāo)象限持續(xù)時間縮短，原平臺所在象限時間占總時間比、原平臺所在象限路程占總路程比下降(P均<0.05)，七氟醚3組麻醉后1 d的目標(biāo)象限路程縮短(P<0.05)；與七氟醚1組比較，七氟醚2組的以上指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；與七氟醚1、2組比較，七氟醚3組麻醉后1 d目標(biāo)象限持續(xù)時間縮短，原平臺所在象限時間占總時間比、原平臺所在象限路程占總路程比下降(P均<0.05)。見表2。

表2 各組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

注：與對照組同期比較，aP<0.05；與七氟醚1組同期比較，bP<0.05；與七氟醚2組同期比較，cP<0.05。

2.3 各組海馬組織中α7-nAchR蛋白和mRNA表達(dá)比較 與對照組比較，七氟醚1、2、3組各時點(diǎn)α7-nAchR蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào)(P均<0.05)；七氟醚1、2、3組各時點(diǎn)進(jìn)行組間比較，α7-nAchR蛋白和mRNA表達(dá)呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 各組海馬組織中α7-nAchR蛋白和mRNA表達(dá)比較

注：與對照組同期比較，aP<0.05。

3 討論

七氟醚廣泛用于全身麻醉的誘導(dǎo)和維持，具有對循環(huán)和呼吸影響小、代謝快、恢復(fù)快、刺激性小的特點(diǎn)。在臨床麻醉中，常選用的有效劑量為1.2～1.5 MAC。有報(bào)道稱短小手術(shù)，腹部手術(shù)、骨科手術(shù)等較長時間、創(chuàng)傷較大的手術(shù)行七氟醚麻醉易導(dǎo)致POCD的發(fā)生。也有報(bào)道稱七氟醚預(yù)處理、后處理可以減少POCD的發(fā)生。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吸入3%、5%的七氟醚會導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能減退，表明吸入七氟醚麻醉對大鼠認(rèn)知功能的影響與吸入的濃度有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，吸入麻醉對認(rèn)知功能影響與吸入時間有關(guān)，大鼠吸入七氟醚麻醉不同時間后，認(rèn)知功能的改變具有時間相關(guān)性[6，7]。但目前吸入七氟醚麻醉對認(rèn)知功能的影響尚不明確。

有研究報(bào)道，成年小鼠吸入七氟醚麻醉3 h可造成認(rèn)知功能損害。李長生等[8]報(bào)道，給予成年小鼠、老年大鼠吸入3%七氟醚麻醉2、4 h均能損害其學(xué)習(xí)探索能力和空間記憶能力，且吸入4 h對認(rèn)知功能影響顯著。水迷宮實(shí)驗(yàn)是用于評估嚙齒類動物空間學(xué)習(xí)記憶功能的方法，其中包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，定位航行實(shí)驗(yàn)主要用于檢測學(xué)習(xí)和記憶存儲能力，空間探索主要用于檢測學(xué)習(xí)和記憶提取能力。本研究結(jié)果顯示，麻醉后1 d，與對照組比較，七氟醚組目標(biāo)象限持續(xù)時間、目標(biāo)象限路程縮短，原平臺所在象限時間占總時間比、原平臺所在象限路程占總路程比下降，提示吸入3%七氟醚麻醉均可引起成年大鼠認(rèn)知功能下降；其中吸入七氟醚5 h較吸入七氟醚1、3 h大鼠的目標(biāo)象限持續(xù)時間、目標(biāo)象限路程縮短，原平臺所在象限時間占總時間比、原平臺所在象限路程占總路程比下降，提示吸入3%七氟醚麻醉5 h使大鼠認(rèn)知功能下降更加顯著，這種影響可能具有時間相關(guān)性。

研究顯示，吸入異氟醚、七氟醚麻醉可損害認(rèn)知功能，麻醉后1周較為顯著，且這種損害作用可持續(xù)數(shù)周[5，9，10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚麻醉后24 h未觀察到藥物殘余效應(yīng)，且吸入麻醉藥導(dǎo)致認(rèn)知功能減退主要發(fā)生在第1周，1周后行水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吸入麻醉組大鼠較對照組大鼠的逃避潛伏期延長[9～11]。因此本研究于麻醉后1 d和7 d對大鼠進(jìn)行行為學(xué)測試。本研究結(jié)果顯示，麻醉后7 d，與對照組比較，七氟醚組目標(biāo)象限持續(xù)時間、目標(biāo)象限路程縮短，原平臺所在象限時間占總時間比、原平臺所在象限路程占總路程比下降，提示吸入3%七氟醚麻醉均可引起成年大鼠認(rèn)知功能下降，且這種影響持續(xù)至少1周。

研究顯示，吸入七氟醚麻醉影響認(rèn)知功能可能與神經(jīng)遞質(zhì)和受體、長時程增強(qiáng)、細(xì)胞毒性作用以及神經(jīng)凋亡等相關(guān)[12]，參與認(rèn)知功能損害甚至導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生機(jī)制甚多。腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)主要包括煙堿型乙酰膽堿能受體、去甲腎上腺素能受體、谷氨酸等。乙酰膽堿作為腦內(nèi)廣泛分布的重要神經(jīng)遞質(zhì)，與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系極為密切。α7-nAchR是腦內(nèi)分布最多的兩型受體之一，前期我們已觀察了吸入3%、5%七氟醚麻醉會損傷大鼠認(rèn)知功能與α7-nAchR表達(dá)下調(diào)參與中樞神經(jīng)炎癥的發(fā)生有關(guān)，且呈濃度依賴性。有研究報(bào)道，吸入七氟醚麻醉可促進(jìn)Aβ生成[13]，患者腦內(nèi)Aβ可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用,并誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β等炎癥因子釋放[14]。TNF-α通過激活腫瘤壞死因子受體-1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；IL-1β通過增加p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體和神經(jīng)死亡因子表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)生長因子前體合成，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[15]；從而損害認(rèn)知功能。α7-nAchR表達(dá)下調(diào)在突觸前膜抑制受體依賴的鈣活化和Ach釋放，在突觸后膜使受體不能接受Ach的興奮而導(dǎo)致認(rèn)知功能損害。在背外側(cè)前額葉皮層，α7-nAchR激活可增加含NR2B亞基的NMDA受體離子通道的開放[16]，位于細(xì)胞膜的NMDA受體在突觸長時程增強(qiáng)過程中起重要作用[17]。α7-nAchR表達(dá)下調(diào)，含NR2B亞基的NMDA受體離子通道的開放減少，從而引起認(rèn)知功能損害。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，七氟醚組麻醉后1 d和7 d腦內(nèi)α7-nAchR表達(dá)均下調(diào)，提示吸入不同時間七氟醚對大鼠造成認(rèn)知功能損害與α7-nAchR表達(dá)下調(diào)有關(guān)，且這種影響可以持續(xù)到麻醉后7 d。七氟醚組麻醉后1 d和7 d腦內(nèi)α7-nAchR表達(dá)呈下降趨勢，但組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示α7-nAchR表達(dá)無時間相關(guān)性，這與水迷宮結(jié)果存在差異。推測引起這種結(jié)果的原因可能與實(shí)驗(yàn)動物的樣本量較少、觀察時間較短有關(guān)。

綜上所述，吸入3%七氟醚麻醉1、3、5 h均可導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能減退，麻醉5 h導(dǎo)致的認(rèn)知功能減退更明顯；這種影響可能與α7-nAchR的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。