松果菊苷對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響及機(jī)制

李鎮(zhèn)宇，王兆濤，汪繼，徐如祥

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬陸軍總醫(yī)院，北京100010)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，其中以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度最高，手術(shù)難度大、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后極差、病死率高[1]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移及侵襲導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的浸潤性生長，難以與正常腦組織分清界限，提高了外科治療的難度；同時(shí)侵襲周遭血管神經(jīng)，導(dǎo)致患者預(yù)后極差。多種分子可以影響膠質(zhì)瘤的遷移及侵襲，其中轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)在此過程中發(fā)揮重要作用[3]。松果菊苷是一種提取自植物肉蓯蓉的純天然化合物，對結(jié)直腸癌、骨肉瘤、肝癌、乳腺癌[2]等多種腫瘤具有抑制作用，但其對腦膠質(zhì)瘤的作用鮮有報(bào)道。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，松果菊苷可以通過阻斷TGF-β的傳導(dǎo)，抑制肝星狀細(xì)胞的激活，從而治療肝硬化[4]。2017年4～12月，我們觀察了松果菊苷是否可以通過阻滯TGF-β從而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲及遷移，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。松果菊苷購于美國Abcam公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、胰蛋白酶購于美國Gibco公司；青、鏈雙抗均購于美國Hyclone公司；CCK-8檢測試劑盒購于日本同仁化學(xué)研究所；Matrigel膠、Transwell小室購于美國Coming公司；結(jié)晶紫購于北京雷根生物科技有限公司；兔抗人TGF-β多克隆抗體購于美國CST公司；鼠抗人GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG二抗購于北京中杉金橋公司；TGF-β過表達(dá)質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒均購于南京巴傲德生物科技有限公司；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將U87、U251細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，每隔2～3 d加入0.025%胰酶消化傳代1次。

1.3 細(xì)胞分組與處理 將細(xì)胞分為對照組、松果菊苷組、TGF-β過表達(dá)組、TGF-β過表達(dá)+松果菊苷組。常規(guī)消化并計(jì)數(shù)U87、U251細(xì)胞后，按1×105/孔接種于6孔板中。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對照組、松果菊苷組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，TGF-β過表達(dá)組、TGF-β過表達(dá)+松果菊苷組轉(zhuǎn)染TGF-β質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24 h向松果菊苷組、TGF-β過表達(dá)+松果菊苷組中加入松果菊苷30 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取各組細(xì)胞，用200 μL槍頭在6孔板底垂直劃線，用37 ℃預(yù)熱的PBS沖洗未貼壁的細(xì)胞。培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后觀察并攝影。使用Image J軟件測定劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率，劃痕愈合率=(1-24 h劃痕面積/0 h劃痕面積)×100%。每組重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。取100 μL無血清高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋的Matrigel膠加入上室中，培養(yǎng)箱中孵育6 h。取各組細(xì)胞制成懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，取200 μL加入上室中；下室中加入600 μL培養(yǎng)液稀釋的高糖DMEM培養(yǎng)基，每組重復(fù)3次。培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，擦去上室表面細(xì)胞，甲醇固定。0.1%結(jié)晶紫溶液染色，清水清洗。風(fēng)干后每個(gè)小室隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.6 細(xì)胞TGF-β蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每孔上樣量為40 μg。10% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液(1×TBST稀釋的5% BSA)封閉1 h。加入兔抗人TGF-β、鼠抗人GAPDH一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜。加入山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h。TBST洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光法曝光顯影。采用Image J分析條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度比值表示TGF-β蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞遷移能力比較 在U87、U251細(xì)胞中，松果菊苷組劃痕愈合率較對照組降低，TGF-β過表達(dá)組較對照組升高；TGF-β過表達(dá)+松果菊苷組較TGF-β過表達(dá)組降低，較松果菊苷組升高(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組細(xì)胞侵襲能力比較 在U87、U251細(xì)胞中，松果菊苷組穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組減少，TGF-β過表達(dá)組較對照組增加；TGF-β過表達(dá)+松果菊苷組較TGF-β過表達(dá)組減少，較松果菊苷組增加(P均<0.05)。見表2。

表1 各組細(xì)胞劃痕愈合率比較

注：與松果菊苷組比較，*P<0.05；與TGF-β過表達(dá)組比較，△P<0.05；與對照組比較，▲P<0.05。

表2 各組穿膜細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)，

注：與松果菊苷組比較，*P<0.05；與TGF-β過表達(dá)組比較，△P<0.05；與對照組比較，▲P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞TGF-β蛋白表達(dá)水平比較 在U87、U251細(xì)胞中，松果菊苷組細(xì)胞TGF-β蛋白表達(dá)量較對照組降低；TGF-β過表達(dá)組較對照組升高；TGF-β過表達(dá)+松果菊苷組較TGF-β過表達(dá)組降低，較松果菊苷組升高(P均<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞TGF-β蛋白表達(dá)水平比較

注：與松果菊苷組比較，*P<0.05；與TGF-β過表達(dá)組比較，△P<0.05；與對照組比較，▲P<0.05。

3 討論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，占成人原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的70%，其中以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度最高，預(yù)后很差，并存在極高的復(fù)發(fā)率[1]。其生長迅速并且浸潤程度高，常侵襲瘤周正常腦組織，包括重要的生命調(diào)控中樞及神經(jīng)和血管，且外科手術(shù)治療存在巨大困難，各種原因?qū)е履[瘤難以切盡，大面積的清除常使患者功能區(qū)受到損害，因此膠質(zhì)瘤手術(shù)以姑息手術(shù)為主。這是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高的一個(gè)重要原因。目前，藥物化療特別是藥物靶向性化療是膠質(zhì)瘤最重要的治療環(huán)節(jié)之一，然而臨床應(yīng)用表明，膠質(zhì)瘤化療效果并不理想。大部分抗腫瘤藥物因難以透過血腦屏障，不能在中樞中保持有效的濃度，無法發(fā)揮其藥理作用。臨床應(yīng)用的化療藥物仍局限于替莫唑胺少數(shù)幾種藥物，且因這類藥物的易耐藥性和高不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用也存在一定的局限性[6]。我國傳統(tǒng)中草藥具有不良反應(yīng)小、易獲取、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，其對腫瘤的療效也得到了部分臨床證實(shí)。從中草藥中篩選有效的腫瘤治療藥物是目前研究的一個(gè)重要發(fā)展方向。

松果菊苷是從肉蓯蓉根部提取的純天然化合物，其主要活性成分為苯乙醇苷類化合物[7]。肉蓯蓉作為中草藥在我國有著幾千年的應(yīng)用歷史，其被證實(shí)存在多種生物效應(yīng)，包括神經(jīng)保護(hù)作用[8]、保肝作用[9]、抗細(xì)胞凋亡[10]、抗衰老[11]、免疫調(diào)節(jié)[12]等，且具有良好的透過血腦屏障的功能，并能在腦內(nèi)維持穩(wěn)定的有效濃度[13]。最新研究表明，松果菊苷可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[2]。在結(jié)直腸癌中，松果菊苷能通過上調(diào)caspase-3和裂解DNA修復(fù)酶誘導(dǎo)DNA氧化，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。Dong等[15]報(bào)道，松果菊苷可通過Mut T同源酶1(MTH1)的催化活性來發(fā)揮抗腫瘤作用。但該藥物對膠質(zhì)瘤的作用罕有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，松果菊苷組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的劃痕愈合率、Transwell小室實(shí)驗(yàn)的穿膜細(xì)胞數(shù)均較對照組降低，提示松果菊苷能夠明顯抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的遷移和侵襲能力，表明松果菊苷具有抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的作用。

TGF-β在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中呈高表達(dá)[16]，是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的重要分子之一。TGF-β屬于轉(zhuǎn)化生長因子超級家族，是一種多功能細(xì)胞因子，其信號通路是一條極為重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，能夠調(diào)控多種不同的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移和黏附、凋亡等。研究表明，TGF-β能夠通過影響腫瘤微環(huán)境、增強(qiáng)侵襲性和抑制免疫細(xì)胞功能來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。TGF-β信號通路與腫瘤發(fā)展之間密切的聯(lián)系使得TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，其在抑制腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移機(jī)制過程中具有重要意義。目前，針對TGF-β及其受體的靶向藥物正在逐步開發(fā)中[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，松果菊苷組細(xì)胞TGF-β蛋白表達(dá)量較對照組降低，TGF-β過表達(dá)+松果菊苷組較TGF-β過表達(dá)組降低。提示應(yīng)用松果菊苷可以下調(diào)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中TGF-β蛋白的表達(dá)，在過表達(dá)TGF-β膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，松果菊苷對細(xì)胞遷移、侵襲及TGF-β蛋白表達(dá)量均產(chǎn)生了部分逆轉(zhuǎn)。進(jìn)一步證實(shí)，TGF-β是松果菊苷抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤遷移和侵襲的重要靶點(diǎn)。因此，我們認(rèn)為松果菊苷可以在體外抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的遷移和侵襲，為松果菊苷的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。