高粱幼嫩葉段愈傷誘導(dǎo)與植株再生

郝艷芳，王良群，劉 勇，張 微，楊 偉，白鴻雁，武 擘

（1高粱遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西晉中030600；2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，山西晉中030600）

0 引言

有效的高粱組培和再生體系是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)定向改良高粱的基礎(chǔ)。從1970年Maseltler等[1]首次以芽原基為外植體培養(yǎng)獲得再生植株開始，到現(xiàn)在已可以從多種外植體的培養(yǎng)獲得再生植株，如未成熟胚[2-3]、成熟胚[4]、莖尖[5-6]、幼穗[7-8]、花藥[9-10]等，其中，未成熟胚和幼穗由于誘導(dǎo)愈傷組織容易，誘導(dǎo)率高和分化率高而被廣泛采用，但其取材受生長(zhǎng)季節(jié)限制，未成熟胚只能在授粉后12～13天，長(zhǎng)約1.0 mm的特定時(shí)間段內(nèi)取材[11]，幼穗也只能在小穗長(zhǎng)度大約為1～3 cm的特定時(shí)間段內(nèi)取材[12]，其他外植體存在再生率不高、取材量少、操作復(fù)雜、實(shí)用性差等缺點(diǎn)，相比之下，來(lái)源于幼苗基部的幼嫩葉段能提供較多的材料，而且操作簡(jiǎn)單易行。Wernicke等[13-14]以8個(gè)品種培養(yǎng)10天的無(wú)菌苗葉段為外植體，在MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，經(jīng)分化得到了7個(gè)品種的再生植株。韓福光等[15]以5～8片葉的高粱幼苗葉段為外植體在含鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到了再生植株，并觀察了后代植株在田間的表現(xiàn)，獲得了耐鹽系。雖然以高粱葉段為外植體的愈傷誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)取得了一定進(jìn)展，但影響愈傷誘導(dǎo)和分化的因素較多，使得葉段愈傷誘導(dǎo)和分化率低，而且很多基因型材料的葉段培養(yǎng)還未見報(bào)道。本研究選取育種上常用的8個(gè)恢復(fù)系為材料，以它們的幼嫩葉段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，研究愈傷組織誘導(dǎo)和植株分化再生過程，從中篩選出誘導(dǎo)率較高、愈傷形態(tài)優(yōu)良、分化率較高的基因型材料，為建立以葉段為外植體的高粱組培體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為‘三尺三’、‘R111’、‘SR30’、‘8643變’、‘RHMC’、‘1383’、‘10941496’、‘晉梁5號(hào)’8個(gè)高粱恢復(fù)系材料，2015年種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所修文試驗(yàn)基地收獲后保存。試驗(yàn)于2016年4月—2017年8月在高粱遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

選取飽滿的高粱種子，先用70%乙醇浸泡滅菌1 min，無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1%的HgCl2水溶液浸泡滅菌15 min（加入2滴吐溫-20），無(wú)菌水沖洗6～8次。滅菌后的高粱種子接種于發(fā)芽培養(yǎng)基S1（表1）中，于(25±1)℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天燈光輔助光照12 h。

待苗長(zhǎng)長(zhǎng)至3～5 cm（約5天）時(shí)，把至葉基向上大約0.5 cm長(zhǎng)的葉取下（圖1A），用解剖刀切成1～2 mm長(zhǎng)的小段（圖1B）接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基S2～S8（表1）中，于(25±1)℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天光照12 h，3周后觀察愈傷組織生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。將誘導(dǎo)出的初級(jí)愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基S9（表1）中繼代培養(yǎng)，每3周繼代1次，繼代2次后，觀察愈傷組織形態(tài)，統(tǒng)計(jì)胚性愈傷誘導(dǎo)率。然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基S10（表1）中培養(yǎng)，25℃，燈光輔助光照，每天16 h，3周后統(tǒng)計(jì)分化率（圖1D）。待苗長(zhǎng)長(zhǎng)至5 cm以上，接種于生根培養(yǎng)基S11（表1）中，當(dāng)再生苗長(zhǎng)出根后（圖1E），移栽于花盆中（圖1F）。

1.3 試驗(yàn)參數(shù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，采用Duncan’s多重比較法進(jìn)行差異顯著性測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 2,4-D濃度對(duì)初級(jí)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

設(shè)置誘導(dǎo)培養(yǎng)基的2,4-濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0mg/L，將R111的幼嫩葉段接于其上培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)，接種3～4天后，有的葉段伸長(zhǎng)至1 cm，有的不伸長(zhǎng)，6～7天后伸長(zhǎng)的葉段一端或兩端膨大，長(zhǎng)出愈傷，不伸長(zhǎng)的葉段褐化變黑，不能長(zhǎng)出愈傷，漸漸死亡。3周后形成直徑為0.5 cm左右的愈傷組織塊，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。由表2可知，2,4-D對(duì)高粱幼嫩葉段愈傷組織誘導(dǎo)有很大的影響，不添加2,4-D的培養(yǎng)基上葉段全部褐化變黑，最終也不能產(chǎn)生愈傷組織。隨著2,4-D濃度的升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率先升高后下降，當(dāng)2,4-D的濃度為2mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)最高為80.86%，并且繼代后褐化率較低，因此，高粱幼嫩葉段誘導(dǎo)愈傷合適的2,4-D濃度為2mg/L。

表1 試驗(yàn)所用培養(yǎng)基

圖1 高粱幼嫩葉段的再生過程

2.2 基因型對(duì)愈傷組織形態(tài)的影響

將不同基因型材料誘導(dǎo)產(chǎn)生的初級(jí)愈傷組織轉(zhuǎn)接入繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，可以發(fā)現(xiàn)不同基因型的繼代情況不同，有的基因型在繼代過程中褐化較少，愈傷胚性較好，而有的基因型褐化較嚴(yán)重，胚性狀況比較差。經(jīng)過2次繼代后，可發(fā)現(xiàn)形成3種不同類型的愈傷組織。其中‘1383’、‘RHMC’、‘晉梁5號(hào)’、‘10941496’的幼嫩葉段形成的愈傷組織多數(shù)為白色或淺褐色半透明，含水量高，分泌粘液的Ⅰ型愈傷組織（圖2A～D）；‘三尺三’、‘R111’、‘8643變’形成的愈傷多數(shù)為淡黃色，表面顆粒狀突起，結(jié)構(gòu)疏松，生長(zhǎng)旺盛的Ⅱ型愈傷組織（圖2E～G）；‘SR30’形成的愈傷多數(shù)為黃綠色，硬質(zhì)塊狀，結(jié)構(gòu)致密，生長(zhǎng)緩慢的Ⅲ型愈傷組織（圖2H）。

2.3 基因型對(duì)誘導(dǎo)率和分化率的影響

由表3可知，在適宜的培養(yǎng)基上，8種高粱基因型的幼嫩葉段都能被誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，但誘導(dǎo)率有很大差異，變幅為5.45%～84.65%。其中‘三尺三’、‘R111’、‘8643變’3個(gè)基因型材料顯著高于其他5個(gè)基因型材料。誘導(dǎo)率和分化率最高的基因型為‘三尺三’，分別為84.65%和22.59%，其次為‘R111’，第三為‘8643變’。初級(jí)愈傷誘導(dǎo)率較低的‘晉梁5 號(hào)’、‘RHMC’、‘1383’3個(gè)基因型材料，分化率也低，分別為6.24%、7.34%、10.52%。‘10941496’和‘SR30’2個(gè)基因型材料最后沒有得到分化苗，是由于‘10941496’所誘導(dǎo)出的初級(jí)愈傷組織在繼代的過程中全部褐化死亡，而‘SR30’的初級(jí)愈傷誘導(dǎo)率很低，誘導(dǎo)出的愈傷為硬質(zhì)塊狀，最后未能分化出苗。

表2 不同2,4-D濃度對(duì)高粱幼嫩葉段初級(jí)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖2 不同基因型高粱幼嫩葉段各自形成的愈傷組織形態(tài)

3 結(jié)論

（1）2,4-D是影響高粱幼嫩葉段愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素，在不添加2,4-D的培養(yǎng)基中不能產(chǎn)生愈傷，隨著2,4-D濃度的升高，誘導(dǎo)率先升高后降低，適宜的2,4-D濃度為2 mg/L。

（2）高粱幼嫩葉段愈傷組織誘導(dǎo)與分化受基因型限制。基因型不僅影響愈傷組織的誘導(dǎo)和分化，還影響愈傷組織的形態(tài)和質(zhì)量。

（3）篩選出了3個(gè)誘導(dǎo)率高、愈傷形態(tài)優(yōu)良且分化率較高的基因型，分別為‘三尺三’、‘R111’、‘8643變’。

4 討論

一般認(rèn)為，禾谷類作物葉片細(xì)胞全能性很低，在離體培養(yǎng)條件下較難再生。然而有報(bào)道指出，幼苗葉基部細(xì)胞具有相對(duì)較強(qiáng)的脫分化形成愈傷組織的能力[16-17]。筆者選取8個(gè)高粱基因型材料，研究源于無(wú)菌苗葉基部的幼嫩葉段愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生過程，從其中6個(gè)基因型中獲得了再生植株。

2,4-D是影響愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素。在愈傷組織誘導(dǎo)初期，一般需較高濃度的2,4-D(2～4 mg/L)[18]。黃璐等[19]研究認(rèn)為，高濃度的2,4-D對(duì)外植體及愈傷組織有傷害作用，容易產(chǎn)生無(wú)性系變異。林國(guó)梁等[20]認(rèn)為高濃度的2,4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和芽的分化有抑制作用。本研究中，未添加2,4-D的培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)愈傷的適宜濃度為2 mg/L，超過適宜濃度時(shí)，隨著2,4-D濃度的升高，誘導(dǎo)率下降，這與林國(guó)梁等的研究一致。

表3 不同基因型高粱幼嫩葉段愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率的比較

不同基因型材料的幼嫩葉段在適宜的2,4-D濃度下都能被誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，但是愈傷組織的誘導(dǎo)率有很大的差異，說(shuō)明基因型是高粱幼嫩葉段組織培養(yǎng)中一個(gè)很重要的影響因素。韓福光等[15]研究發(fā)現(xiàn)高粱愈傷組織的誘導(dǎo)率，不同基因型間存在差異，這與本研究的結(jié)果一致。而王良群等[21]的研究認(rèn)為基因型對(duì)誘導(dǎo)率的影響不大，這可能與試驗(yàn)所選擇的基因型種類和數(shù)量有關(guān)。基因型不僅對(duì)幼嫩葉段愈傷誘導(dǎo)率有很大影響，還對(duì)愈傷組織的形態(tài)和質(zhì)量有很大影響，筆者所選用的8個(gè)基因型材料，經(jīng)2次繼代后產(chǎn)生3種不同類型的愈傷組織，這與陳靖等[22]的研究一致。愈傷組織質(zhì)量反映的是愈傷組織的胚性狀況，是關(guān)系到愈傷能否分化的一個(gè)重要因素[23-24]，本研究中，能產(chǎn)生優(yōu)良質(zhì)量愈傷組織的‘三尺三’、‘8643變’、‘R111’這3個(gè)基因型材料有較高的分化率，而不能產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)愈傷的其他5個(gè)基因型材料分化率很低，‘10941496’、‘SR30’2個(gè)基因型甚至沒有得到再生苗。

本研究中，以高粱無(wú)菌苗幼嫩葉段為外植體，從6個(gè)基因型材料中得到再生植株（圖1D～F），說(shuō)明幼嫩葉段可作為高粱組培研究和利用的一種可供選擇的外植體。雖然高粱轉(zhuǎn)化研究工作中，常常選擇幼胚或幼穗作為受體材料[25-26]，但是在非生長(zhǎng)季節(jié)，幼嫩葉段不失為一種很好的選擇。但不足的是，本研究中胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率和分化率偏低，如何提高胚性愈傷誘導(dǎo)率和分化率是今后需要解決的問題。