二甲雙胍聯(lián)合順鉑對孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制

馮文,孫敏,張吉瑞,楊成喜

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港第一人民醫(yī)院，江蘇連云港 222000)

子宮內(nèi)膜癌多好發(fā)于圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性，病死率高。目前臨床仍以手術(shù)治療為主，對于晚期、復(fù)發(fā)及有意愿保留生育功能的部分患者，放化療、激素治療是較佳選擇[1,2]。大劑量孕激素治療雖對孕激素受體陽性、子宮內(nèi)膜不典型增生者療效頗佳，有效率可達(dá)70%。但其禁忌證較多，應(yīng)用受限，對孕激素耐藥患者效果不佳[3]。單獨(dú)放療、化療較少用于子宮內(nèi)膜癌的治療，多以術(shù)后輔助放療聯(lián)合化療的形式用于臨床。一線所用化療藥物主要是順鉑，有較好的劑量反應(yīng)效應(yīng)，增加劑量可使療效增高，但在達(dá)到預(yù)期治療效果的同時毒性作用亦隨之增大[4]。林瓊燕等[5]研究顯示，順鉑的作用效應(yīng)可能與mTOR信號通路有關(guān)。mTOR 信號通路被證實(shí)參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡過程。王夢瑩等[6]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有激活A(yù)MPK信號通路，抑制mTOR活化(磷酸化)，進(jìn)而抑制耐孕激素子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的潛在價值。順鉑及二甲雙胍可能存在藥物的增強(qiáng)作用，但是否能協(xié)同治療內(nèi)宮內(nèi)膜癌鮮見報道。2013年1月～2014年12月，我們觀察了二甲雙胍聯(lián)合順鉑對孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 高分化孕激素耐藥的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞(ERα、β、PR均呈陽性)由北京大學(xué)人民醫(yī)院惠贈。注射用順鉑(批號：20140372)，規(guī)格：10 mg×5支，購自齊魯制藥有限公司；二甲雙胍(批號：20120056)、甲羥孕酮(批號：23020715)購自美國Simga公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；小牛血清、胰蛋白酶及乙二胺四乙酸(EDTA)消化液購自美國Hyclone 公司；二甲基亞砜DMSO(批號：2017/05/09)購自上海滬崢生物科技有限公司；TRIzol試劑、熒光PCR分析試劑盒及細(xì)胞裂解液均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；兔抗人AMPK多克隆抗體、p-AMPK(磷酸化位點(diǎn)-蘇氨酸172)多克隆抗體、p-mTOR多克隆抗體(磷酸化位點(diǎn)-絲氨酸2448)及mTOR單克隆抗體、GAPDH一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗羊二抗均購自北京百奧萊博科技有限公司；ELX800全自動酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司)、Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國BD公司)、LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR系統(tǒng)(美國RCHO公司)、全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將Ishikawa細(xì)胞常規(guī)接種含10%優(yōu)質(zhì)小牛血清及雙抗(100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素)的RPMI1640高糖培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)，保持孵箱37 ℃恒溫，調(diào)節(jié)CO2濃度至5%，相對濕度為90%。觀察細(xì)胞狀態(tài)，單層貼壁生長，每2 d換液1次，細(xì)胞融合度達(dá)80%時，棄培養(yǎng)基，PBS洗凈，0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化傳代，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 孕激素耐藥的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系構(gòu)建 甲羥孕酮用DMSO溶解制成濃度為15 μmol/L的母液，后稀釋為實(shí)驗(yàn)所需濃度。取上述對數(shù)期細(xì)胞，換用含甲羥孕酮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，調(diào)節(jié)甲羥孕酮濃度為1 μmol/L 的起始含量，持續(xù)誘導(dǎo)Ishikawa細(xì)胞。每隔2 d更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞80%左右融合時消化傳代并誘導(dǎo)，4代后采用高濃度甲羥孕酮培養(yǎng)基，按照2.5、5、7.5、10、15 μmol/L的規(guī)格每周增加藥物濃度。若被誘導(dǎo)的Ishikawa細(xì)胞能在最大濃度15 μmol/L的甲羥孕酮培養(yǎng)基中的增殖速率對等其在普通培養(yǎng)基中的增殖速率時可認(rèn)為耐藥成功。

1.4 細(xì)胞抑制率測算 采用MTT法。取處于耐藥成功的Ishikawa細(xì)胞，反復(fù)吹打成調(diào)整密度制成單細(xì)胞懸液(1×105/mL)，接種于96孔板中，各孔約100 μL，貼壁厚無血清24 h培養(yǎng)，加入各組藥物(均為100 μL)。各組處理如下：二甲雙胍組：加入稀釋后的不同濃度的二甲雙胍(終濃度為1、2.5、5、10、15 mmol/L)；順鉑組：加入濃度為5、12.5、25、50、75 μmol/L的順鉑；聯(lián)合用藥組：為使藥物濃度一致，二甲雙胍聯(lián)合順鉑以各自相應(yīng)的終濃度按1∶200進(jìn)行給藥；對照組：未添加任何藥物的無血清培養(yǎng)液處理的細(xì)胞；空白組：無藥物及細(xì)胞的培養(yǎng)液。每組設(shè) 4個平行孔，加藥后各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h ，更換培養(yǎng)液同時終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后每孔加入20 μL的 MTT 5 g/L，于37 ℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)培育4 h，排槍小心吸去上清，加入150 μL DMSO，避光條件下用振蕩器搖勻10 min，溶解紫色結(jié)晶。放置酶標(biāo)儀在490 nm波長處測量各孔吸光度(A)值，計算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率%=[1-(A處理組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計算二甲雙胍與順鉑的半數(shù)抑制濃度(IC50)。根據(jù)計算的IC50，后續(xù)研究中用10 mmol/L二甲雙胍(二甲雙胍組)、60 μmol/L順鉑(順鉑組)、10 mmol/L二甲雙胍+60 μmol/L順鉑(聯(lián)合用藥組)處理細(xì)胞48 h。

1.5 藥物聯(lián)合作用評價 根據(jù)各組計算的IC50，運(yùn)用CompuSyn軟件計算二甲雙胍與順鉑聯(lián)合用藥的聯(lián)合指數(shù)(CI)，當(dāng) CI<1時提示兩藥有協(xié)同作用；CI=1時提示兩藥作用性質(zhì)為相加效應(yīng) ；CI>1則提示兩藥存在拮抗效應(yīng)。

1.6 細(xì)胞凋亡率測算 收集耐藥后的Ishikawa細(xì)胞，以2×105/mL接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長后以無血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，二甲雙胍組、順鉑組、聯(lián)合用藥組分別添加等量10 mmol/L二甲雙胍、60 μmol/L順鉑，10 mmol/L二甲雙胍+60 μmol/L順鉑，以不施加任何藥物的完全培養(yǎng)基為對照組。培養(yǎng)48 h后用胰酶消化細(xì)胞，加入NB血清終止，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入400 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞并計數(shù)。將細(xì)胞懸液置于流式管中，先后加入500 μL Binding Buffer溶液、5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V混合液和5 μL Propidium Iodide溶液，小心混勻，避光孵育30 min，隨即加入400 μL結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個樣本檢測1×105～5×105個細(xì)胞。

1.7 各組細(xì)胞mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時熒光定量PCR法。將耐藥成功的腫瘤細(xì)胞接種于常規(guī)培養(yǎng)皿中，24 h培養(yǎng)后，二甲雙胍組、順鉑組、聯(lián)合用藥組分別用10 mmol/L二甲雙胍、60 μmol/L順鉑、10 mmol/L二甲雙胍聯(lián)合60 μmol/L順鉑處理細(xì)胞72 h。TRIzol試劑裂解細(xì)胞提取RNA，紫外分光光度計分析總RNA，按試劑盒說明書每組取等量RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行PCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，Bcl-2、Bax反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s (40 個循環(huán))；72 ℃ 10 min。用全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)采集圖像并記錄電泳結(jié)果，以目的基因條帶/GAPDH條帶值表示基因的相對表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。本實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因及目的基因引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計，Bcl-2正向引物為5′-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAACC-3′，反向引物為5′-GCATCCCAGCCTCCGTTATC-3′，引物大小為304 bp；Bax 正向引物5′-TGCTTCAGGGTTTCATCCAG-3′，反向引物5′- GGCGGCAATCATCCTCTG -3′，引物大小為257 bp。

1.8 各組細(xì)胞p-AMPK、p-mTOR蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取上述三組細(xì)胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8 h后取出。PBS沖洗細(xì)胞2次，100 μL RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，振蕩混勻，BCA法測定蛋白濃度。12 000 r/min 離心，各組取等量蛋白溶液加樣于10% SDS聚丙烯酰胺凝膠中，電泳分離目的蛋白質(zhì)，將分離后的蛋白質(zhì)以恒壓120 V濕轉(zhuǎn)膜，室溫下用含50 g/L脫脂奶粉TBST封閉2 h；加入稀釋(1∶1 000)后的p-AMPK、AMPK、mTOR、GAPDH一抗和稀釋(1∶200)后的p-mTOR一抗，4 ℃搖床過夜；次日漂洗后加入稀釋(1∶2 000)后的IgG二抗，室溫下避光孵育1 h，PBS再次洗膜后ECL暗室顯影。應(yīng)用Image J軟件，以目的基因蛋白電泳條帶灰度值與GAPDH內(nèi)參蛋白灰度值比值表示其相對表達(dá)水平的高低，操作重復(fù) 3 次。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 培養(yǎng)48 h后，經(jīng)方差分析提示，二甲雙胍在2.5～15 mmol/L(F=8.481，P=0.000)、順鉑在12.5～70 μmol/L(F=12.467，P=0.000)濃度內(nèi)孕激素耐藥的Ishikawa細(xì)胞增殖受到抑制，且具有劑量依賴性效應(yīng)，二者抑制作用隨藥物濃度的增高而逐漸增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。二甲雙胍的IC50為(10.44±0.57)mmol/L、順鉑為(60.22±0.78)μmol/L。二甲雙胍在終濃度為10、15 mmol/L時聯(lián)合順鉑(對應(yīng)終濃度為50、75 μmol/L)對腫瘤細(xì)胞的抑制程度高于二者單用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

注：與二甲雙胍組相比，aP<0.05；與順鉑組相比，bP<0.05；與對照組相比，cP<0.05。

圖1 MTT法檢測二甲雙胍及順鉑對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

2.2 藥物聯(lián)合效應(yīng)評價 各濃度二甲雙胍聯(lián)合對應(yīng)濃度的順鉑均具有協(xié)同作用，在順鉑20 μmol/L聯(lián)合二甲雙胍5 mmol/L左右，呈現(xiàn)明顯協(xié)同效應(yīng)。見表1。

表1 不同濃度二甲雙胍聯(lián)合順鉑的聯(lián)合指數(shù)

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 對照組、二甲雙胍組、順鉑組、聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率分別為2.46%±0.34%、19.51%±2.07%、26.14%±2.53%、37.19%±3.08%，4組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.421，P=0.000)。同對照組相比，二甲雙胍組(q=5.372，P<0.05)、順鉑組(q=4.149，P<0.05)、聯(lián)合用藥組(q=10.068，P<0.05)的凋亡率均增高。近一步分析，聯(lián)合用藥組對比順鉑組及二甲雙胍組，細(xì)胞凋亡率分別上升了11.17%±1.87%、17.63%±1.28%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q順鉑=7.015，q二甲雙胍=14.233；P<0.05)。

2.4 三組目的基因相對表達(dá)量比較 三組Bcl-2的相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.742，P=0.035)。其中，聯(lián)合用藥組 Bcl-2相對表達(dá)量最低，其次為順鉑組(P<0.05)；聯(lián)合用藥組Bax/Bcl-2水平高于順鉑組及二甲雙胍組(P均<0.05)；而三組Bax mRNA的相對表達(dá)量比較，P均>0.05，見圖2。

2.5 三組相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 三組p-AMPK、p-mTOR蛋白相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.326，P=0.007)；聯(lián)合用藥組p-AMPK蛋白表達(dá)較二甲雙胍組、順鉑組高(P<0.05)，而p-mTOR蛋白表達(dá)則低(P<0.05)。

注：與二甲雙胍組相比，aP<0.05；與順鉑組相比，bP<0.05。

圖2 各組目的基因相對表達(dá)含量的檢測結(jié)果分析

順鉑組p-AMPK蛋白表達(dá)高于、p-mTOR低于二甲雙胍組(P均<0.05)。AMPK、mTOR總蛋白水平變化不明顯，三組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見圖3、圖4。

圖3 三組蛋白印記檢測結(jié)果分析

注：與二甲雙胍組相比，aP<0.05；與順鉑組相比，bP<0.05。

圖4 三組相關(guān)蛋白表達(dá)分析

3 討論

保守治療更適于年輕化且有生育需求的子宮內(nèi)膜癌患者，通過孕激素拮抗雌激素固然是臨床較佳選擇。然而，近年流行病學(xué)數(shù)據(jù)及細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)提示，大量、長期使用孕激素可使子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對其敏感性下降，形成耐藥[7]。常用化療藥物順鉑由于其能破壞DNA正常表達(dá)，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，通常以聯(lián)合用藥方式減輕其劑量，但就目前現(xiàn)有化療藥物組合來看，治療效果難達(dá)預(yù)期，新的聯(lián)合方案則多從協(xié)同順鉑作用通路著手?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍除能抑制糖異生、促進(jìn)脂肪酸氧化外，亦具有激動AMPK，抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力。二甲雙胍聯(lián)合順鉑在治療黑色素瘤方面已初見成效，同時，王小慧等[8]研究中證實(shí)單用二甲雙胍可改善子宮內(nèi)膜癌惡性增殖情況，其用藥安全，不良反應(yīng)小，聯(lián)合順鉑治療孕激素耐藥的子宮內(nèi)膜癌有望成為臨床新的輔助治療方案。

二甲雙胍可通過直接及間接的方式影響腫瘤細(xì)胞代謝，間接作用依賴于p-AMPK(AMPK活化形式)的生成，抑制糖異生相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及骨骼肌對葡萄糖的攝取能力，此機(jī)制可減少胰島素對腫瘤細(xì)胞有絲分裂的促進(jìn)作用，與多種腫瘤細(xì)胞的增殖過程相關(guān)，此在牛藝潔等[9]的研究中有所闡述。直接作用則是通過增加p-AMPK負(fù)調(diào)控其下游物質(zhì)-mTOR的磷酸化(活化形式)。磷酸化的mTOR參與多種生長因子整合過程，亦是PI3K/Art信號通路中重要的調(diào)控分子，與腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡息息相關(guān)。本研究中，二甲雙胍在2.5～15 mmol/L濃度范圍內(nèi)明顯抑制了細(xì)胞增殖，且該抑制作用隨濃度增加而增加，濃度過低未能達(dá)到藥物有效濃度，濃度高于15 mmol/L的效應(yīng)仍需進(jìn)一步討論。早期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，雷帕霉素聯(lián)合順鉑治療肺癌細(xì)胞具有明顯協(xié)同作用，因雷帕霉素為mTOR抑制劑，可下調(diào)mTOR信號通路下游分子，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性[10]。本研究MTT結(jié)果顯示，二甲雙胍終濃度為10、15 mmol/L時聯(lián)合順鉑(對應(yīng)終濃度為50、75 μmol/L)能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，高于二者單用，同時聯(lián)合指數(shù)提示二甲雙胍聯(lián)合順鉑對Ishikawa細(xì)胞的生長抑制具有協(xié)同作用。二甲雙胍能降低p-mTOR的表達(dá)，減弱其下游分子p70S6K對AKt的負(fù)反饋抑制，降低癌細(xì)胞對順鉑的耐藥程度，增強(qiáng)其細(xì)胞毒性，這可能是二者具有協(xié)同作用的原因，與Soyama等[11]研究結(jié)論相似。

Bcl-2是細(xì)胞凋亡中關(guān)鍵的癌基因之一，能抑制凋亡，其基因家族中的Bax基因則是一種極為重要的促凋亡基因，過度表達(dá)可拮抗Bcl-2的抗凋亡作用。在正常情況下Bax與Bcl-2間保持一定比例，二者間的動態(tài)平衡調(diào)節(jié)促凋亡因子Caspase-3表達(dá)，決定了細(xì)胞的存亡[12]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組對比二甲雙胍組及順鉑組可明顯下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，而Bax并未發(fā)生明顯變化，二者比值隨Bcl-2基因表達(dá)產(chǎn)物的降低而增大，此提示二甲雙胍聯(lián)合順鉑可促進(jìn)孕激素耐藥子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bcl-2是Akt信號通路的下游分子，當(dāng)p-Akt因p-mTOR受抑制而減少時，磷酸化Bad隨即下調(diào)，抑制Bcl-2的抗凋亡作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。更值得關(guān)注的是，Bcl-2表達(dá)與腫瘤耐藥存在正向關(guān)系，聯(lián)合用藥組Bcl-2表達(dá)降低提示細(xì)胞對藥物的敏感性可能有所提升[13]。本研究PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果同流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果一致，聯(lián)合用藥組的凋亡率高于二甲雙胍組、順鉑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示二甲雙胍聯(lián)合順鉑具有促進(jìn)孕激素耐藥Ishikawa細(xì)胞凋亡的潛力。Western blotting結(jié)果提示，二甲雙胍聯(lián)合順鉑可抑制腫瘤增殖、促進(jìn)凋亡，機(jī)制可能與AMPK/mTOR通路有關(guān)，AMPK活化增高，mTOR活化降低，但二者總蛋白AMPK及mTOR含量未見明顯變化。說明二甲雙胍聯(lián)合順鉑對細(xì)胞通路的作用可能集中于目的基因翻譯修飾后[14]，未曾改變基因本身的表達(dá)，對細(xì)胞正?；顒佑绊戄^小。

綜上所述，二甲雙胍聯(lián)合順鉑對孕激素耐藥的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞有協(xié)同作用，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，該作用機(jī)制可能與AMPK/mTOR通路相關(guān)。