miR-21對肝細胞缺氧復氧損傷的影響

王艷靜，李恒力，許丙輝，劉昭明，張憲峰，夏時海

(1哈勵遜國際和平醫院，河北衡水053000；2哈勵遜國際和平醫院；3中國人民武裝警察部隊醫學院)

肝癌是一種常見的肝臟原發性惡性腫瘤，預后較差。肝癌的發病受環境因素和遺傳因素共同影響，其中肝臟缺血-再灌注損傷(IRI)為主要的病因之一[1]。IRI為在缺血的基礎上恢復血流后，組織損傷反而加重，甚至產生不可逆性損傷的現象[2]。IRI的發病機較復雜，包括細胞內鈣超載、炎性反應、氧化應激等，IRI可導致肝臟損傷，引起肝竇狀細胞、肝細胞、膽管上皮細胞死亡，甚至造成患者死亡。缺氧復氧(H/R)的細胞模型能模擬IRI過程，當前在體外研究中較常見。PTEN又名MMA1或TEP1，屬抑癌基因，可通過下調腫瘤相關信號傳導通路實現腫瘤抑制，亦可抑制腫瘤細胞增殖、浸潤轉移[3]。PTEN是PI3K/AKT信號通路激活過程的負調控因子，其抑制腫瘤的主要機制是去磷酸化PIP3為PIP2，從而抑制PIK3的致癌活性，導致腫瘤細胞的侵襲和轉移[4]。微小RNA(miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的調控性小RNA分子，其中miRNA-21編碼基因定位于跨膜蛋白(TMEM49)基因編碼區域內，可參與細胞增殖、生長、發育、凋亡等生物過程，不過主要在轉錄后水平對基因表達發揮負調控作用[5]。PTEN是miRNA-21的下游靶基因且被其負向調控[6]，但在肝細胞缺氧復氧損傷中的應用尚無相關報道。2016年7月～2018年4月，本研究探討了miR-21對肝細胞缺氧復氧損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2肝癌細胞系購于中國科學院上海細胞庫，并已進行細胞株鑒定，保存于本科室。miR-21 mimic購自廣州銳博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自Invitrogen公司；羊抗鼠PTEN、PI3K/、KT多克隆抗體與GAPDH內參抗體購自Santa Cruz 公司；Annexin V FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自Med Systems公司；所有引物與測定由英駿生物技術有限公司完成。

1.2 肝細胞缺氧復氧損傷模型的建立 HepG2細胞用含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM細胞培養液進行培養，細胞每48 h換液1次。取對數生長期的細胞，更換為不含糖、不含血清的DMEM培養液，放入MGC缺氧培養裝置中培養12 h，更換培養液為含1O%胎牛血清的高糖型DMEM培養液，常規復氧培養6 h。

1.3 細胞分組與處理 將HepG2細胞隨機分為4組，正常組、缺氧復氧組、miR-21 mimic處理組(實驗組)、NC組，正常組不予任何處理，缺氧復氧組及實驗組建立肝細胞缺氧復氧損傷模型，實驗組在進行缺氧復氧前2 h，HepG2細胞內加入miR-21 mimic 100 nmol/L。NC組在缺氧復氧2 h前，加入等體積的無效miRNA。

1.4 miR-21表達檢測 采用實時熒光定量RT-PCR法。收集各組的細胞，提取細胞總RNA，miR-21實時定量RT-PCR使用引物：正向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，反向引物：5′-GCGGTCAAGAGCAATAACGAA-3′。在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行，以U6作為內參。

1.5 細胞存活率檢測 采用CCK-8法。將HepG2細胞以5×104/mL的密度接種至96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，繼續培養24 h。各組分別處理完畢后，每孔中加入1 μL的CCK-8檢測試劑，培養2 h后使用酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光度，計算細胞存活率。

肝癌具有診斷困難、惡性程度高、發病初期癥狀不明顯、病死率高等特點。在肝癌的發病過程中，多伴有IRI，其不僅可誘發肝功能異常、繼發炎癥反應和細胞凋亡等，亦是導致肝癌患者死亡的主要原因之一[7]。采用混合厭氧氣體培養細胞建立缺氧復氧模型對細胞無潛在的化學損傷，能較好地模擬機體缺氧，當前應用較廣泛[8]。肝細胞IRI是涉及諸多復雜級聯反應的病理生理過程，包括活性氧、活性氮、中性粒細胞、血小板、細胞因子、凝血系統等激活。本研究結果顯示，缺氧復氧組的細胞存活率低于正常組，LDH活性高于正常組，表明肝細胞缺氧復氧損傷模型建立成功。

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1.7 細胞中PTEN、AKT蛋白表達檢測 采用Western blotting法。離心收集各組處理后的細胞，使用400 μL的RIPA裂解液進行裂解，12 000 r/min離心5 min，取上清蛋白進行BCA法測定濃度。SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，加一抗、4 ℃孵育過夜。二抗孵育后PBS清洗3次，每次5 min，最后曝光置于Odyssey熒光檢測儀中，檢測目的條帶，使用GAPDH作為內參。

2.3 各組細胞凋亡率比較 實驗組、NC組、缺氧復氧組、正常組細胞凋亡率分別為20.21%±1.73%、45.46%±1.63%、47.83%±1.45%、2.14%±0.33%，與正常組相比，缺氧復氧組、實驗組、NC組的細胞凋亡率升高(P均<0.05)，其中缺氧復氧組的細胞凋亡率最高(P<0.05)。

2.4 各組PTEN、AKT蛋白表達比較 缺氧復氧組PTEN、AKT蛋白相對表達量分別為1.98±0.24、1.67±0.22，正常組PTEN、AKT蛋白相對表達量分別為0.14±0.09、1.11±0.42，缺氧復氧組PTEN、AKT蛋白表達高于正常組(P均<0.05)；實驗組PTEN、AKT蛋白相對表達量分別為0.89±0.24、0.78±0.22，實驗組PTEN、AKT蛋白表達低于缺氧復氧組(P均<0.05)。

2.2 各組細胞存活率與LDH活性對比 缺氧復氧組的細胞存活率低于正常組(P<0.05)，LDH活性高于正常組(P<0.05)；實驗組的細胞存活率高于缺氧復氧組(P<0.05)，LDH活性低于缺氧復氧組(P<0.05)。見表1。

2 結果

2.1 各組miR-21表達比較 實驗組、NC組、缺氧復氧組、正常組miR-21相對表達量分別為145.33±22.18、2.33±1.02、2.71±1.22、16.65±0.98，缺氧復氧組的miR-21表達量低于正常組(P<0.05)，實驗組高于缺氧復氧組(P<0.05)。

(2)根據各系統模塊提供的數據，自動計算水泥成本。具體為：根據人力資源管理系統數據，將管理費用等自動分攤到各個工序中；根據生產管理系統數據，分別計算水泥的不同配方和不同品種的產量，自動計算各水泥品種的生產成本。

表1 各組細胞存活率與LDH活性比較±s)

1.8 乳酸脫氫酶(LDH)活性測定 各組細胞處理完成后，取20 μL上清用于LDH活性測定。上清與檢測工作液混勻后，37 ℃溫浴2 h，室溫放置5 h，在450 nm處測量吸光度值，計算各組樣本培養上清中的LDH的活性。

首先以“剝落的墻皮”暗喻已經流逝的歲月，二者都有“無法回到最初狀態”的特點。喻體墻皮剝落的過程正是本體歲月離開的最細節性的表現。

3 討論

1.6 細胞凋亡檢測 采用雙染法。處理后的細胞用4 ℃預冷的PBS清洗，加入250 μL結合緩沖液重新懸浮細胞，調整細胞濃度為5×105/mL，取200 μL的細胞懸液，加入10 μL的Annexin聯膜蛋白V-異硫氰酸熒光素+10 μL濃度20 μg/mL的碘化丙錠，避光孵育10 min，加入500 μL的PBS后上流式細胞儀分析。

miRNA是一類內源性的非編碼小分子RNA，miRNA可與靶mRNA的3′非翻譯區3′UTR結合，從而調控靶基因的表達。miR-21在染色體上的位置是17q23.1的FRA17B 區域上，miR-21基因具有高度保守性，可參與腫瘤的形成。在肝癌、胃癌、宮頸癌等細胞或組織中，miRNA-21表達均顯著升高[9]，但目前尚無關于肝細胞IRI的miRNA表達譜及其變化的研究報道。本研究實時熒光定量PCR結果顯示，缺氧復氧組的miR-21表達量低于正常組，實驗組高于缺氧復氧組，差異有統計學意義，表明肝臟IRI伴有miR-21表達下降。

細胞存活率與細胞凋亡情況是反映細胞損傷程度的重要指標，細胞上清中的LDH活性變化反映細胞壞死程度。本研究結果顯示，缺氧復氧組的細胞存活率低于正常組，LDH活性高于正常組；實驗組的細胞存活率高于缺氧復氧組，LDH活性低于缺氧復氧組，差異有統計學意義；與正常組相比，缺氧復氧組、實驗組、NC組細胞凋亡率升高，其中缺氧復氧組的細胞凋亡率最高，差異有統計學意義。從機制上分析，氧化應激被認為是導致器官IRI過程中細胞損傷的主要原因，缺血時器官氧氣供應不足，之后的再灌注過程中氧氣供應隨之恢復，導致LDH的生成，從而破壞細胞結構的穩定性，并且可進一步誘發細胞凋亡，miR-21的加入增強了肝細胞對缺氧-復氧損傷的保護作用[10]。

PTEN名為與張力蛋白同源、第10染色體丟失的磷酸酶基因，有9個外顯子和8個內含子，全長200 kb，有9個外顯子和8個內含子[11]。PTEN蛋白定位于細胞質，呈網格狀分布。PTEN是具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，其正常表達抑制腫瘤細胞侵襲、轉移與生長[12]。PTEN基因在肝癌、子宮內膜癌、卵巢癌、乳腺癌等組織中的突變及失活均可通過下調腫瘤相關信號傳導通路實現腫瘤抑制。PTEN的抑癌功能主要體現在參與PTEN/PI3K/Akt多條信號傳導通路，發揮其誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期、激活脂質磷酸酶與蛋白磷酸酶活性等作用[13]。PTEN的3′-UTR區含有miR-21的結合位點，PTEN被認為是miR-21的靶基因之一，抑制肝癌細胞中miR-21表達可使PTEN的表達增加，抑制細胞的增殖、轉移與侵襲[14]。本研究結果顯示，缺氧復氧組的PTEN、AKT蛋白表達高于正常組，實驗組的PTEN、AKT蛋白表達低于缺氧復氧組，差異有統計學意義。表明miR-21在IRI發生發展中發揮致癌基因作用，可能通過抑制PTEN/PI3K/Akt蛋白表達調控調節細胞的增殖和凋亡[15，16]。

周教授說，我給你們講啊，理論上講就是真的了。一么，他們服裝不像是演電影的服裝，裝備也不像演電影的裝備，都是貨真價實的。二么，他們的長相就是東方人的長相，東方人的長相我是專門研究過的么。這三么，他們打了我，你們想么，要是真演電影怎么可能那樣真打我？這四么，要是真拍電影，怎么連攝影機都看不到？既然不拍，演了何用么？

綜上所述，miR-21可抑制PTEN/PI3K/AKT信號通路，減輕缺氧復氧導致的肝細胞凋亡，提高肝細胞存活率，抑制LDH釋放，從而減輕肝細胞損傷，但具體調控機制尚需進一步研究。