3D培養(yǎng)人工皮膚組織黑色素瘤模型建立及評價

謝敏，李明英，張帆，劉慶平，秦建中，遲彥,3

(1大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧大連 116001；2大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院·糖脂代謝重點實驗室；3遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

惡性黑色素瘤是由黑色素細胞惡性轉(zhuǎn)化形成的惡性腫瘤，具有高侵襲和高轉(zhuǎn)移特性，我國惡性黑色素瘤發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1,2]。腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致黑色素瘤患者死亡的主要原因。皮膚惡性黑色素腫瘤細胞從表皮組織侵襲生長，穿越基底膜進入真皮層是他們向遠端其他組織和器官轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，干預(yù)黑色素腫瘤細胞侵襲生長，已成為國內(nèi)外預(yù)防和治療該腫瘤的研究熱點[3,4]。目前，研究者主要利用腫瘤細胞移植建立的動物模型研究黑色素腫瘤轉(zhuǎn)移特性或篩選抗腫瘤化合物，但這些模型均是將腫瘤細胞直接注射于動物皮下組織或血管內(nèi)，轉(zhuǎn)移速度取決于腫瘤細胞的生長速度和進入血管的難易程度，不能考察腫瘤細胞侵襲和穿透基底膜的能力，此為研究黑色素瘤細胞侵襲生長的分子機制及抑制侵襲生長的藥物篩選帶來了困難[5,6]。2015年8月～2018年3月，我們采用體外人工皮膚組織3D培養(yǎng)技術(shù)，將黑色素瘤細胞摻入到人工皮膚的表皮層，模擬生理條件下黑色素腫瘤細胞在局部擴散和侵襲過程，為研究黑色素瘤的侵襲生長特性提供研究模型。

1 材料與方法

1.1 材料 人黑色素瘤A375和C8161細胞購自南京凱基生物有限公司,胎牛血清購自Gemini Bio-Products公司。DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司。Ⅰ型膠原、胰島素、表皮生長因子購自Sigma公司，Ⅳ型膠原、層黏連蛋白抗體、E-鈣黏素抗體購自Santa Cruz。

1.2 原代細胞分離與培養(yǎng) 原代皮膚成纖維細胞和表皮細胞均來源于包皮環(huán)切術(shù)后被切除的包皮組織。將皮膚置于含抗生素的PBS漂洗后，剪棄脂肪和結(jié)締組織，將皮膚剪成約0.5 cm2的小塊，加入dispase消化過夜。次日，用眼科鑷子仔細將表皮剝離用于分離表皮角質(zhì)形成細胞，將剩余真皮和皮下組織塊置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)2～3周，至成纖維細胞在組織塊周邊擴散生長，收集細胞，傳代擴增。將剝離的表皮組織進一步切碎，加入0.25%胰蛋白酶消化15 min，反復(fù)吹打制備細胞懸液，接種于60 mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)于含5%胎牛血清，表皮生長因子，抗生素的DMEM/F-12(3∶1)培養(yǎng)基中，待角質(zhì)形成細胞長出克隆后，消化收集細胞，并傳代擴增，將擴增至第3代的角質(zhì)形成細胞用于人工皮膚3D培養(yǎng)。

1.3 黑色素瘤A375細胞和C8161細胞的培養(yǎng) 人黑色素瘤A375細胞或C8161培養(yǎng)于普通DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含3.7 g/L的碳酸氫鈉，不同濃度(0.5%或5%)的胎牛血清，100 μg/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素。隔天換液1次，待細胞達到80%～90%融合時，用PBS沖洗，0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞接板，進行后續(xù)實驗。

1.4 人工表皮組織制備 制備人工皮膚組織使用BD公司生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)小室(polycarbonate)，置于12孔細胞培養(yǎng)板中。首先用適量酸溶解的I型膠原蛋白與成纖維細胞懸液混合，加入培養(yǎng)小室(1 mL/個)，在室溫靜置40 min，待膠原蛋白凝固后，將培養(yǎng)小室放入細胞培養(yǎng)板中，加滿含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，此為人工真皮層。次日將角質(zhì)形成細胞(0.5×106)與黑色素腫瘤細胞按比例1∶5混合，接種于在人工真皮層表面，置于細胞培養(yǎng)板孔中，加滿含不同濃度血清(無血清、0.5%、5%)和表皮生長因子的細胞增生培養(yǎng)液(DMEM/F-12)，在浸泡狀態(tài)下培養(yǎng)2 d(浸泡培養(yǎng))。然后吸除小室內(nèi)培養(yǎng)液，并將小室移置于含有高起的金屬網(wǎng)架上，使濾膜的細胞側(cè)暴露于空氣，并將表皮細胞分化培養(yǎng)液加到小室的外部空間，使液面與小室底部平齊(氣/液界面培養(yǎng))，每2 d更換新鮮培養(yǎng)液1次，直至表皮組織出現(xiàn)細胞終末分化的特征。

1.5 人工皮膚組織中不同黑色素瘤細胞的侵襲能力觀察 人工皮膚組織，經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制備組織切片。HE染色時，組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇和PBS水化，用Hematoxylin和Eosin染色，脫水，封片，鏡下觀察并照相。比較黑色素瘤細胞C8161和A375侵襲能力。

1.6 基底膜蛋白表達檢測 人工皮膚組織經(jīng)OCT包埋，干冰乙醇速凍后，制作冰凍切片。切片經(jīng)甲醇固定后，在室溫用5%BSA封閉，然后加適當稀釋的抗Ⅳ型膠原蛋白抗體，抗層黏連蛋白(laminin)抗體，在室溫孵育1 h。洗片后，再加入熒光素標記的二抗孵育1 h。再次洗片，加入DAPI染色5 min，顯示細胞核，在熒光顯微鏡下觀察細胞分布和基底膜蛋白表達。

1.7 細胞E-鈣黏素分泌情況檢測 將黑色素瘤A375細胞和C8161細胞、皮膚角質(zhì)形成細胞爬片，加入抗E-鈣黏蛋白抗體，激光共聚焦檢測檢測三種細胞E-鈣黏素分泌情況。

1.8 不同黑色素瘤細胞生長速度檢測 向6孔細胞培養(yǎng)板接種黑色素瘤細胞C8161和A375(50 000/孔)，置于人工皮膚3D培養(yǎng)基中，于2、4、7、10 d用血球計數(shù)板計數(shù)，檢測細胞生長速度。

1.9 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。首先制備Matrigel包被小室膜，形成人工基底膜，4 ℃保存?zhèn)溆谩375和C8161腫瘤細胞于無血清培養(yǎng)液中饑餓12 h，用含2%血清的培養(yǎng)液收集懸浮細胞，接種于Transwell小室內(nèi)(100 000細胞/室)，下室24孔板中加入含10%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)22 h，每組3個復(fù)孔。取出Transwell小室，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)細胞，將小室倒置風干，結(jié)晶紫染色小室膜外側(cè)面細胞，顯微鏡下(200×)計數(shù)細胞，計算10個不同視野內(nèi)細胞總數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同血清濃度對人工皮膚組織中腫瘤細胞生長的影響 HE染色表明，血清濃度在5%和0.5%時，C8161腫瘤細胞生長狀態(tài)良好，呈現(xiàn)向真皮侵襲的特征，而無血清培養(yǎng)時腫瘤無明顯生長和侵襲。此外，表皮細胞在0.5%血清濃度時，表皮結(jié)構(gòu)清晰完整，角質(zhì)形成細胞生長分化良好。后續(xù)實驗采用0.5%作為3D培養(yǎng)人工表皮組織的血清濃度。

2.2 人工皮膚組織中不同黑色素瘤細胞侵襲能力比較 C8161細胞具備侵襲能力，培養(yǎng)1周，可見C8161細胞剛剛突破基底膜，而隨著培養(yǎng)時間的延長，至培養(yǎng)第2周后，侵襲更為深入，而相同條件下培養(yǎng)的A375細胞的侵襲能力明顯弱于c8161細胞，基底膜下層僅有少量腫瘤細胞分布。見圖1。

圖1 HE染色檢測不同黑色素瘤細胞侵襲能力

2.3 人工皮膚組織中基底膜形成與黑色素瘤細胞的侵襲能力 無腫瘤細胞的人工皮膚組織可見清晰的紅色線狀結(jié)構(gòu)(基底膜蛋白陽性染色)，基底膜形成良好。在含有黑色素腫瘤細胞的人工皮膚組織中，亦可見膜蛋白陽性染色。但在含C8161細胞的組織中雖可見基底膜標記蛋白的陽性反應(yīng)，未呈現(xiàn)連續(xù)，整齊的線狀結(jié)構(gòu)，而表現(xiàn)為彎曲和彌散的分布特征，大量腫瘤細胞位于人工真皮組織中，提示基底膜不完整。與此相反，含A375細胞的人工皮膚組織，未呈現(xiàn)顯著的腫瘤侵襲，多數(shù)腫瘤細胞位于基底膜上層，基底膜結(jié)構(gòu)完整，與HE染色結(jié)果相似。見圖2。

圖2 免疫熒光檢測不同黑色素瘤細胞侵襲能力

2.4 細胞E-鈣黏連素分泌情況比較 表皮角質(zhì)形成細胞分泌E-鈣黏連素，而黑色素瘤細胞C8161、A375則不產(chǎn)生E-鈣黏連素。

2.5 不同黑色素瘤細胞生長速度比較 A375、C8161兩種腫瘤細胞在3D培養(yǎng)液中培養(yǎng)10 d，均持續(xù)保持增殖狀態(tài)。相較于C8161細胞，A375細胞在單層細胞培養(yǎng)條件下細胞生長速度更快。見圖3。

圖3 不同時點黑色素瘤細胞生長速度比較

2.6 不同黑色素瘤細胞侵襲能力比較 C8161細胞穿過Transwell濾膜的細胞數(shù)為32 000±258(10個200×視野)，而穿過濾膜的A375細胞數(shù)僅為250±16(10個200×視野)，二者比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。

3 討論

黑色素腫瘤惡性程度高，主要因此類腫瘤細胞極易從表皮組織浸潤，穿破基底膜，進入真皮和皮下組織的血管發(fā)生轉(zhuǎn)移[7]。現(xiàn)有研究技術(shù)和手段很少有模擬生理條件下黑色素瘤侵襲過程。目前，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移模型，主要是Transwell實驗或腫瘤細胞移植動物模型。Matrigel包被的Transwell濾膜雖具有人工基底膜的屏障作用[8]，但并非生理條件下細胞所分泌的基底膜蛋白成分，該方法不能用于考察腫瘤微環(huán)境中多種細胞間的相互作用。在腫瘤移植動物模型中，腫瘤細胞被直接注射于皮下組織或血管內(nèi)，不能考察腫瘤細胞在局部侵襲和遷移的能力。本研究建立的體外人工皮膚組織腫瘤模型，不僅含有角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞和膠原蛋白組成的立體構(gòu)架，還能模擬生理條件生成表皮基底膜。腫瘤細胞在人工皮膚組織中的生長和侵襲行為接近于體內(nèi)生理條件下腫瘤生長和轉(zhuǎn)移特性[9,10]，因此用此模型研究黑色素腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機制及干預(yù)過程，有更多優(yōu)勢。

由于A375和C8161腫瘤細胞常規(guī)生長在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，而在人工皮膚3D培養(yǎng)中，血清濃度過高，血清中的鈣離子會促進表皮角質(zhì)形成細胞的分化，所以我們首先探討3D細胞培養(yǎng)液中最佳血清濃度。本研究通過對培養(yǎng)液血清濃度優(yōu)化，成功建立了即適合于表皮組織分化又能維持腫瘤細胞長時間生長的3D培養(yǎng)條件。即0.5%作為3D培養(yǎng)人工表皮組織的血清濃度。免疫熒光技術(shù)觀察結(jié)果顯示，表皮基底膜在空氣/液相培養(yǎng)1周即可形成，侵襲力弱的A375細胞主要局限于基底膜表皮側(cè)，而侵襲力強的C8161細胞則彌散分布于不完整的基底膜兩側(cè)。隨著培養(yǎng)時間延長(2～3周)腫瘤細胞向人工真皮層的擴散逐漸增強，提示通過3D培養(yǎng)建立的人工表皮組織，能較好模擬病理條件下的黑色素瘤細胞侵襲過程，為藥物篩選和機理分析提供了研究模型。

目前黑色素腫瘤細胞穿過基底膜，侵襲生長的機理尚不清楚。我們觀察到黑色素瘤細胞的遷移和侵襲與生長速度并無直接關(guān)系。在單層細胞培養(yǎng)中A375細胞的增殖速度雖高于C8161細胞，但C8161在3D人工皮膚模型中的侵襲和遷移能力卻顯著大于前者，提示侵襲力是不同腫瘤細胞的固有特征，這一點在廣泛使用的Transwell實驗中亦得到證實。有文獻報道，E-鈣黏蛋白對于抑制腫瘤細胞侵襲和遷移有重要作用，諸多腫瘤細胞失去分泌E-鈣黏素的能力，轉(zhuǎn)而產(chǎn)生N-鈣黏素[11]。正常角質(zhì)形成細胞表達豐富的E-鈣黏素，位于細胞與細胞連接處[3]。兩種腫瘤細胞均不表達E-鈣黏素，但細胞侵襲生長卻顯著不同，提示在本實驗條件下，失去E-鈣黏素表達能力并不是導(dǎo)致腫瘤細胞侵襲遷移的必要條件。利用本研究所建立的模型，可進一步研究腫瘤細胞可能分泌的基質(zhì)蛋白酶和其他因子對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

目前，多數(shù)抗腫瘤化合物篩選是在培養(yǎng)的單層細胞條件下進行。越來越多的證據(jù)表明，單層細胞培養(yǎng)所得到的結(jié)果與體內(nèi)實驗差異較大。由于立體培養(yǎng)可以更真實地模擬腫瘤細胞在體內(nèi)生長特性，因此用3D培養(yǎng)的腫瘤細胞篩選抗腫瘤藥物是藥物研發(fā)的重要手段[12]。本研究所建立的模型不僅可觀察腫瘤細胞侵襲生長，對于體外篩選有效的抗腫瘤藥物亦有重要價值。