胃癌組織中GTSE1的表達及意義

許昊，喻鑫，裴世界，于東風，劉弋

(1安徽醫科大學第一附屬醫院，合肥230022；2六安市兒童醫院)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著診療技術的不斷提高，胃癌發病率有所下降[1]。當前胃癌主要采取以手術為主的綜合治療，早期胃癌患者術后5年生存率可達95%以上，但因早期胃癌臨床癥狀不典型，多數患者就診時已處于進展期，術后5年生存率甚至低于30%[2,3]。近年來，隨著分子生物醫學技術的不斷發展，分子靶向治療因其特異性和敏感性較高成為提高胃癌患者生存率的另一重要途徑[4]。研究者發現基因型和表觀遺傳的改變與胃癌的發生發展及預后密切相關，如果基因編碼的蛋白質主要在腫瘤組織中異常表達并參與腫瘤的形成過程，那么該蛋白質可能是理想的腫瘤生物標志物和分子靶向治療靶點[5,6]。G2/S期應答相關蛋白1(GTSE1)由位于染色體22q13.2-q13.3的基因編碼而成，僅于細胞周期的S期和G2期特異表達，可通過促進p53的降解而抑制p53誘導的細胞凋亡[7]。Guo等[8]研究發現，GTSE1在肝癌組織中異常高表達，且其高表達與腫瘤浸潤程度及預后差相關。最近有文獻[7]報道在胃癌細胞中高表達的GTSE1可通過p53凋亡信號通路降低鉑類化療藥物對胃癌治療的敏感性，但對于GTSE1的表達與胃癌患者臨床病理特征及生存預后的關系尚不明確。2017年8月，我們觀察了GTSE1在胃癌組織中的表達，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年5～7月安徽醫科大學第一附屬醫院經普外科手術切除的12對新鮮胃癌組織及相應癌旁正常胃組織(距癌組織邊緣>5 cm)，患者男7例、女5例，年齡37～78(55.33±11.91)歲?；颊呓洸±頇z查證實均為胃腺癌，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期5例，Ⅲ～Ⅳ期7例；組織分化程度為高/中分化7例，低/未分化5例；有淋巴結轉移者8例，無淋巴結轉移者4例。組織被取下后迅速放入液氮，再移至-80 ℃冰箱保存。免疫組化所用標本選自2011年12月～2012年2月經安徽醫科大學第一附屬醫院普外科手術切除的56例胃癌患者，男31例、女25例，年齡29～80(61.16±11.38)歲，腫瘤位置：賁門/胃底部28例，胃體/胃竇部28例。腫瘤直徑>5 cm者19例，≤5 cm者37例。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期33例；組織分化程度為高/中分化19例，低/未分化37例；有淋巴結轉移者32例，無淋巴結轉移者24例。將其胃癌及癌旁正常胃組織(距癌組織邊緣>5 cm)制成石蠟切片(切片約4 μm厚)，用于后續的免疫組織化學實驗。對上述患者進行定期隨訪，隨訪采取患者復診或電話聯系患者家屬或患者本人等方式進行。術后前2年每3個月隨訪1次，以后每6個月隨訪1次，直至患者去逝或至隨訪截止日期(2017年2月)，隨訪時間2～62個月，中位隨訪時間43個月，5年生存率為21.4%。總生存期為從隨訪開始到患者死亡或隨訪結束所經歷的時間，如果在隨訪期間患者尚未死亡或者患者失訪，則到最后隨訪結束的這段時間稱為截尾數據(刪失值)。以上所有患者臨床資料完整，均簽署知情同意書，并獲安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，術前均未進行放化療，無其他腫瘤史，且術后均經病理檢查確診為胃腺癌。

1.2 12例份胃癌組織中GTSE1 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。取12對新鮮胃癌組織標本，按TRIzol RNA試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書提取總RNA，根據RevertAid cDNA合成試劑盒(美國賽默飛生物科技公司)說明書逆轉錄合成cDNA，取2 μL逆轉錄產物進行PCR擴增，PCR反應條件：95 ℃變性10 min，緊接著進行40個循環：95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，然后根據SYBR Green染色法進行相對定量分析，結果采用2-ΔΔCt法計算。PCR擴增引物：GTSE1正向引物：5′-CCACCGGGATGTTCTCCCT-3′，反向引物：5′-TTCAGCCCCAACTTGTTTGGA-3′；GAPDH作為內參，正向引物：5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，反向引物：5′-CAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3′。實驗均重復3次。

1.3 12例份胃癌組織中GTSE1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取12對新鮮胃癌組織標本，用RIPA裂解液和PMSF(碧云天生物技術公司)提取組織蛋白，其濃度根據BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術公司)說明書檢測，取相同濃度蛋白于聚丙烯凝膠中進行電泳，經PVDF膜轉膜后用封閉液封閉1 h，按1∶3 000稀釋一抗，將裁剪后的PVDF膜分別浸入上述濃度的一抗中，4 ℃冰箱內孵育過夜，按1∶6 000稀釋二抗，再將膜浸入二抗中室溫下振蕩孵育1 h，最后經電化學發光后進行顯影曝光得到所需條帶，GAPDH作為內參，Image J軟件分析目的條帶相對灰度值。實驗均重復3次。

1.4 56例胃癌患者癌組織中GTSE1蛋白表達檢測 采用免疫組化法。采用Polink-1 HRP DAB 檢測系統(中杉金橋)技術(二步法)。首先，石蠟組織切片經過二甲苯脫蠟和不同濃度梯度的乙醇中水化后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，將切片放入檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH 6.0)中予以抗原修復，再用3% H2O2去離子水消滅內源性過氧化物酶活性，經PBS清洗3次后滴加一抗(抗GTSE1單克隆抗體，1∶200)，于4 ℃孵育過夜，另一組用PBS代替一抗作為陰性對照。次日，用PBS清洗切片3次后滴加酶標二抗(PV-6000山羊抗兔IgG/HRP聚合物)40 μL，放入提前預熱的37 ℃恒溫箱中孵育20 min，然后按照DAB試劑盒說明書步驟進行染色，最后封片后由兩名完全不知道切片信息且有經驗的病理學專家對切片的染色結果進行判讀。采用陽性細胞百分比評分與染色強度評分之積法(PI)對免疫組化結果進行分析。以細胞核出現棕黃色或棕褐色顆粒的細胞為陽性細胞，在高倍顯微鏡下，隨機選取5個視野進行觀察。按陽性細胞百分比評分：無細胞著色為0分；陽性細胞≤25%為1分；26%～74%為2分；≥75%為3分。按染色強度評分：無細胞著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。兩項得分≤4分計為陰性表達，>4分計為陽性表達。

2 結果

2.1 GTSE1在新鮮胃癌及癌旁正常胃組織中的表達比較 qRT-PCR實驗結果表明，胃癌組織中GTSE1 mRNA高表達率為83.33%(10/12)，相應癌旁正常胃組織為16.67%(2/12),二者比較，P=0.002。Western blotting實驗結果顯示，胃癌組織中GTSE1蛋白表達率為83.33%(10/12)，高于相應癌旁正常胃組織的16.67%(2/12)，二者比較差異有統計學意義(P=0.004)。

2.2 56例胃癌患者癌及相應癌旁正常胃組織中GTSE1蛋白表達比較 免疫組化檢測結果表明，GTSE1蛋白主要表達于細胞質，且GTSE1蛋白在癌及癌旁正常胃組織中的陽性表達率分別為73.21%(41/56)、14.29%(8/56)，二者比較差異有統計學意義(P<0.001)。

2.3 GTSE1蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系 GTSE1蛋白陽性表達與胃癌患者腫瘤大小、組織分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期有關(P均<0.05)，而與患者的性別、年齡和腫瘤位置無關(P均>0.05)，且腫瘤惡性程度相對較高的胃癌患者GTSE1陽性表達率較高，見表1。

2.4 生存分析 Kaplan-Meier生存曲線分析結果表明，GTSE1蛋白陽性表達者5年生存率為8.3%，低于陰性表達者的55%，二者比較差異有統計學意義(P<0.05)；GTSE1蛋白陽性、陰性表達者的生存期分別為(34.972±2.843)、(51.800±3.262)個月，中位生存期分別為37、60個月，二者比較，差異有統計學意義(P<0.001)。

2.5 預后影響因素分析 COX單因素回歸分析結果表明，腫瘤大小、組織分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期和GTSE1表達是影響胃癌患者預后的重要因素(P均<0.05)，見表2。COX多因素回歸模型結果顯示，TNM分期和GTSE1表達是胃癌患者預后的重要獨立影響因素(P均<0.05)，見表3。

表1 GTSE1蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系

表2 影響胃癌患者預后的單因素分析

表3 影響胃癌患者預后的多因素COX回歸分析

3 討論

目前，胃癌的治療方法取得較大進展，胃癌發病率明顯下降，但病死率仍較高[9]。對于無遠處轉移的胃癌患者，手術治療是絕對適應證，而對于晚期胃癌患者，化療和分子靶向治療是當前較理想的治療方案[4, 10]。但由于耐藥性的出現限制了腫瘤化療的有效性，而分子靶向治療因其特異性強和敏感性高的特點成為當前研究重點，為改善胃癌預后提供了重要的治療策略。臨床研究證實，曲妥珠單抗(HER2的靶向治療藥物)治療HER2陽性的胃癌患者明顯延長了胃癌患者的生存期并提高了患者的生存率[11]。但由于當前發現的諸多分子標志物在胃癌中表達的特異性相對較差，因此尋找新的特異性較強的分子治療靶點是當前研究熱點。

GTSE1是一種細胞周期調控的微管相關蛋白質，在非轉化細胞中，細胞周期G1期表達較低，S期增加，G2期達到峰值；相反，在轉化細胞中，GTSE1蛋白在細胞周期所有階段表達均增加，其高表達與部分癌癥的發生發展相關[7,12,13]。在肝癌中GTSE1高表達與腫瘤大小、血管侵犯、臨床分期和臨床差預后顯著相關，而敲除GTSE1可抑制肝癌細胞的增殖、侵襲、轉移和促進肝癌細胞凋亡，這一機制可能是通過使PI3K/AKT通路和凋亡相關蛋白失活實現；另外，沉默GTSE1會增加5-FU的抗腫瘤效應[8]，由此可見，GTSE1在肝癌發生發展和治療等方面發揮重要作用。最近，Subhash等[7]研究發現，下調GTSE1表達可增強鉑類化療藥物對胃癌細胞的抗增殖和生長抑制效應及增加p53誘導的細胞凋亡效應，具體機制尚不清楚。

本研究結果顯示，GTSE1 mRNA和蛋白在胃癌組織中的表達高于在癌旁正常胃組織中,差異有統計學意義，此與Subhash等[7]研究結果一致，說明GTSE1可能作為一種促癌基因在胃癌發生過程中起重要作用。免疫組化實驗結果表明,GTSE1主要表達于細胞質，且在胃癌組織中的表達高于癌旁正常組織，與Western blotting實驗結果一致。此外，GTSE1蛋白高表達與胃癌組織的大小、浸潤深度、組織分化、淋巴結轉移、TNM分期等顯著相關，且腫瘤惡性程度越高者，GTSE1蛋白陽性表達率越高，說明GTSE1蛋白在胃癌進展過程中發揮重要作用，但具體機制有待進一步研究。Kaplan-Meier生存分析結果表明，GTSE1蛋白陽性表達的胃癌患者術后總體生存率較低，另外，在單因素分析和多因素COX回歸模型分析結果表明GTSE1表達可作為預測胃癌患者預后的獨立影響因素?？傊珿TSE1表達可作為胃癌術后生存預后的獨立負性指標，此與GTSE1在肝癌中的研究結果類似，為指導胃癌術后常規進行GTSE1免疫組化染色評估患者生存預后有重要意義。

綜上所述，GTSE1在胃癌組織中過表達，過表達的GTSE1與胃癌患者差的臨床預后及浸潤深度、淋巴結轉移、分化程度、TNM分期等臨床病理特征相關，可作為預測胃癌患者預后的獨立指標，可能成為胃癌分子靶向治療的重要靶點。