體外沉默PD-L1在T淋巴細胞細胞毒作用中的影響

白云龍 王建杰

（佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007）

PD-L1（程序性死亡受體配體1）是免疫負向調控共刺激分子[1]，主要表達于上皮細胞、腫瘤細胞、活化的T淋巴細胞、調節性T淋巴細胞和樹突樣細胞等[2]。一部分腫瘤細胞可以激發出特異性免疫應答，當T淋巴細胞對腫瘤進行特異性細胞免疫應答時，腫瘤細胞的TLRs（Toll樣受體）可以介導上調PD-L1的表達量，而且一部分腫瘤細胞特異性高表達PD-L1，比如三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231。從而削弱針對腫瘤細胞的特異性細胞免疫應答[3]。所以PD-L1對于增強細胞特異性免疫應答有著重要的意義，從而以PD-L1為靶點的藥物開發有著重要的臨床意義。本實驗正是以體外實驗為基礎，評價PD-L1對于增強T淋巴細胞的細胞毒作用的效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑：MDA-MB-231人乳腺癌細胞株購自上海諾辰生物技術有限公司。胎牛血清購自clark公司，L15培養基購自gibco公司。轉染試劑脂質體3000購自themor公司。淋巴細胞分離夜購自biosharp公司。PD-L1干擾質粒、無關對照干擾質粒、過表達質粒和空白質粒均由上海吉凱基因生物技術公司合成。細胞裂解液和蛋白酶抑制劑購自biosharp公司。PD-L1抗體、GAPDH、辣根過氧化物酶的兔抗鼠二抗購自成都正能生物技術公司。CD107a單克隆抗體購自R&D公司，FITC兔抗鼠標記抗體購自sigma公司。

1.2 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231的培養：由于人乳腺癌細胞株MDA-MB-231需要L15培養基和無CO2的條件，所以在培養時選用細胞培養瓶瓶蓋不透氣的那種，除此之外其他條件相同。培養基中加10%的胎牛血清，37 ℃培養，2 d傳代1次。

1.3 外周血單個核細胞的分離和與腫瘤細胞共培養：抽取志愿者外周血10 mL，放入抗凝管中，混勻，用等體積生理鹽水稀釋共20 mL。分裝入事先裝有2 mL淋巴分離夜的4個離心管中，2500 rmp離心20 min。懸浮于淋巴分離夜中的細胞即為外周血單個核細胞。將外周血單個核細胞吸入新的離心管中加入RPMI1640培養基10 mL，2500rmp離心5 min洗滌3次以洗除血小板。洗后倒掉培養基加入含10%胎牛血清的RPMI1640重新懸浮細胞，加入六孔板中每空1.5 mL，而后每孔加入溶于1 mLL15培養基中的1.5×106個腫瘤靶細胞。由于想得到活化的T淋巴細胞，必先活化抗原提程細胞包括樹突狀細胞。所以首先每孔加入一萬單位的重組人干擾素伽瑪使樹突狀細胞處于可激活狀態。1 d后，加入脂多糖，一種Toll樣受體配體，每孔10 μL，濃度100 μg/μL，培養3 d。

1.4 用western blotting的方法檢測轉染PD-L1siRNA干擾質粒和過表達PD-L1質粒PD-L1的表達情況。

共培養3 d后，T淋巴細胞被激活，活化的靶向腫瘤細胞的特異性T淋巴細胞開始形成[4]。由于T淋巴細胞不貼壁，懸浮于培養液中，所以換液時將細胞培養液吸入離心管中再加入PBS定容混勻，離心2500 rmp，5 min，倒掉液體加入培養基吹勻，繼續和靶細胞共培養。1 d后將六孔板的細胞分成5組，分別是不做任何處理組、轉染PDL1siRNA組、轉染無關siRNA組、空質粒組、PD-L1過表達組。

1.5 用流式細胞方法檢測：取六孔板中已轉染細胞，將細胞刮下用PBS清洗3遍，用4%多聚甲醛固定0.5 h，之后用PBS洗3遍，4 ℃一抗孵育1 h后，用PBS洗1遍，再4 ℃避光二抗孵育0.5 h后洗3遍，然后上機檢測。

2 結 果

2.1 western blotting 檢測，一共做了3次，蛋白表達情況趨勢均相同，取其中一次結果，見圖1，PD-L1siRNA干擾組，PD-L1的表達明顯下調，而PD-L1過表達組PD-L1表達上調，不做任何處理組、空質粒組、無關siRNA組無明顯變化。

2.2 流式細胞檢測，一共做了3次，波峰移動趨勢均相同，其中一次結果見圖2，PD-L1siRNA組與不做任何處理組、空質粒組、無關siRNA組、PD-L1過表達組比較，熒光強度增加，波峰右移。

3 討 論

圖1 WESTERN BLOT法檢測各組細胞PD-L1蛋白表達情況

圖2 流式細胞檢測PD-L1對T淋巴細胞細胞毒作用的影響

依靠人體自身免疫系統去預防和治療腫瘤，這無疑是最理想的治療方式。從1863年德國醫師魏爾嘯發現腫瘤組織浸潤大量免疫細胞開始，到現在科學家一直為這個理想努力著，但是這一理想始終沒能實現。除了腫瘤本身因素比如惡性程度比較高的腫瘤細胞抗原提程能力下降使機體免疫系統無法有效識別，此外最主要的原因就是機體免疫系統對腫瘤的殺傷存在負向調控機制[5]。本實驗研究的PD-L1就是其中之一。無論是正常上皮細胞還是惡變的細胞，也就是腫瘤細胞，都存在PD-L1的表達，一些腫瘤細胞表面的表達量更高[6]。PD-L1的表達主要受TLR4-NF-κB -IL-6-stat3信號通路的調控[7]。CD107a是溶酶體膜相關糖蛋白，活化的T淋巴細胞殺傷靶細胞依靠的是顆粒酶和穿孔素。它們的本質就是分泌型溶酶體。CD107a就存在于包繞它們的脂質雙分子層中。在活化的T淋巴細胞脫顆粒時，溶酶體膜和細胞膜發生融合，溶酶體膜中的糖蛋白即CD107a也融在了細胞膜表面，所以CD107a可以衡量T淋巴細胞細胞毒作用的強度。流式檢測結果，PDL1siRNA干擾組的細胞與其他組相比波峰右移，說明熒光強度比其他組要強，證明了下調PD-L1可以增強細胞免疫強度。這也為腫瘤的生物治療提供了一個思路。