Lowry法測(cè)量重組艾塞那肽蛋白含量的不確定度分析

邱文娜 吳宏斌 方朝東 王永智 熊吉濱

江蘇省泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心，江蘇泰州 225300

艾塞那肽（Exendin-4）是合成肽類(lèi)，具有腸促胰島素分泌激素（Incretin）類(lèi)似物效應(yīng)。該產(chǎn)品首次由美國(guó)Amylin制藥公司開(kāi)發(fā)合成，主要用于控制血糖，改善胰島素抵抗[1-3]。目前該藥品無(wú)其他公司生產(chǎn)，且無(wú)藥典收藏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)室利用基因工程技術(shù)，經(jīng)過(guò)純化、濃縮、凍干等工藝，得到重組艾塞那肽。蛋白含量是該產(chǎn)品質(zhì)量控制的一項(xiàng)重要內(nèi)容，本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)中國(guó)藥典2015年版三部/四部通則0731 第二法，經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，建立了本產(chǎn)品蛋白含量測(cè)定的方法[4-8]。

不確定度是與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，測(cè)量結(jié)果的表述需同時(shí)包含被測(cè)量值及與該值相關(guān)的測(cè)量不確定度[9-11]，本文依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定和表示》、《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》中的有關(guān)規(guī)定，參考已發(fā)表文章的方法[12-13]，對(duì)艾塞那肽蛋白含量測(cè)定的不確定度進(jìn)行分析[12-17]，以期望找到影響其不確定度的各種因素，為客觀評(píng)價(jià)艾塞那肽蛋白含量的檢驗(yàn)結(jié)果提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 樣品

艾塞那肽由本實(shí)驗(yàn)室提供，樣品約2mg/支。

1.2 主要試劑及儀器

堿性銅溶液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，臨用前配制）；牛血清白蛋白（中國(guó)食品藥品檢定研究所，批號(hào)為 140619-201622）；酚試劑（2N，Sigma101308200）；水為超純水，其他試劑為分析純；電子天平 Sartorius BSA224S-CW；紫外分光光度計(jì)Thermo Biomate3s。

2 檢測(cè)方法

2.1 酚試劑準(zhǔn)備

用移液管取2N 酚試劑10mL置棕色瓶中，并加入10mL水配制成1N濃度酚試劑。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液制備

精確稱(chēng)取0.1g牛血清白蛋白，加100mL水定量稀釋至1mg/mL作為貯備液；用移液管精密量取貯備液2.5mL置25mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

2.3 樣品制備

精密稱(chēng)取樣品約2mg至試管中，加入2mL水使溶解，混勻，并取50μL稀釋至250μL作為供試品進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及供試品濃度的測(cè)定

預(yù)先打開(kāi)紫外分光光度計(jì)，選好程序（Lowry法，波長(zhǎng)650nm，標(biāo)準(zhǔn)樣品數(shù)為5，對(duì)應(yīng)濃度依次輸入 20，40，60，80，100μg/mL，并選擇 Linear選項(xiàng)）。

精密量取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別于試管中，加水至1mL（并以1mL水作空白對(duì)照），加堿性銅溶液5mL，搖勻，室溫放置10min，快速加入酚試劑0.5mL，搖勻，室溫放置30min顯色；同時(shí)，分別取50μL供試品于不同的3個(gè)試管內(nèi)作為3次重復(fù)，其它操作同標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。

顯色后，以標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白質(zhì)濃度對(duì)應(yīng)其吸光度作直線回歸，求得直線回歸方程，并將供試品溶液吸光度代入直線回歸方程，計(jì)算供試品蛋白質(zhì)濃度，及樣品蛋白含量。

3 不確定度來(lái)源分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及儀器直接測(cè)定出的OD值所計(jì)算得到的結(jié)果為稀釋后溶液中的蛋白含量，通過(guò)式（1）根據(jù)稱(chēng)取樣品的質(zhì)量、樣品溶液體積和稀釋倍數(shù)可計(jì)算出樣品的蛋白含量：

其中c為稀釋后供試品中蛋白濃度；a為稀釋倍數(shù)；V為樣品溶液體積；m為樣品的總質(zhì)量，mg。

根據(jù)數(shù)學(xué)模型，不確定度的來(lái)源主要來(lái)自：（1）蛋白濃度的測(cè)定；（2）供試品稀釋?zhuān)唬?）加樣體積；（4）樣品稱(chēng)量。

4 各分量不確定度的評(píng)定

4.1 供試品蛋白濃度測(cè)定的相對(duì)不確定度

供試品濃度測(cè)定的不確定度主要來(lái)源于方法重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

4.1.1 供試品測(cè)定重復(fù)性的相對(duì)不確定度urelx1

表1 標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與所測(cè)OD值

供試品蛋白吸光度值共重復(fù)三次測(cè)量（結(jié)果為 0.109、0.111、0.108），將測(cè)定的供試品 OD 值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程，得到稀釋后的供試品蛋白濃度 C樣品分別為 40.46、41.23、40.08μg/mL，平均值 C樣品為40.6μg/mL；計(jì)算原樣品中蛋白含量平均值為40.6×5=203μg/mL。

采用A類(lèi)不確定度評(píng)定方法計(jì)算供試品測(cè)定重復(fù)性的不確定度分量（n=3），根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算

4.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的相對(duì)不確定度urelx2

（1）標(biāo)準(zhǔn)品純度的相對(duì)不確定度urel（p）

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)食品藥品檢定研究所提供，標(biāo)識(shí)蛋白含量為23.5mg，未給出純度和限度標(biāo)識(shí)，參照基準(zhǔn)物質(zhì)的含量，假定其含量為（23.5±0.05）%[5]，視為矩形分布（包含因子K=），則由此帶來(lái)的不確定度為：

相對(duì)不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量帶來(lái)的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量不確定度來(lái)自天平稱(chēng)量重復(fù)性和天平校準(zhǔn)兩個(gè)方面：

天平稱(chēng)量重復(fù)性的不確定度，所用電子天平（d=0.01mg）天平檢定證書(shū)列出的重復(fù)性誤差為±0.05mg，屬B類(lèi)不確定度，按矩形分布（包含因子K=），天平稱(chēng)量重復(fù)性的不確定度為u1(m)=0.0289。

天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度，所用電子天平（d=0.01mg）的檢定證書(shū)給出的最大允差為±0.03 mg，屬 B 類(lèi)不確定度，按矩形分布（包含因子K=），天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度為：

因此，單次稱(chēng)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(mi)=0.0337，標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量帶來(lái)的相對(duì)不確定度為（標(biāo)準(zhǔn)品的稱(chēng)樣量為101.5mg）：

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程帶來(lái)的不確定度

該項(xiàng)不確定度包括玻璃量器體積檢定的不確定度和溫度引起的不確定度。

本實(shí)驗(yàn)室所用的A級(jí)5mL單標(biāo)移液管，經(jīng)查檢定證書(shū)：容量允差為±0.015mL，按矩形分布（包含因子K=），則由移液管帶來(lái)的不確定度分量為：

本實(shí)驗(yàn)室所用的A級(jí)25、100mL容量瓶，經(jīng)查檢定證書(shū)：容量允差分別為±0.030mL、±0.10mL，按三角分布（包含因子K=），則由 25、100mL 容量瓶產(chǎn)生的不確定度分量分別為：

因?qū)嶒?yàn)環(huán)境均在空調(diào)下進(jìn)行，設(shè)定室溫為（20±5）℃，水的膨脹系數(shù)為 2.1×10-4℃，按矩形分布，移液管、容量瓶因環(huán)境溫度引進(jìn)的不確定度分別為

綜上，由5mL移液管及25、100mL容量瓶帶來(lái)的相對(duì)不確定度分別為:

則標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程帶來(lái)的不確定度為：

綜上，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的相對(duì)不確定度

4.2 供試品稀釋帶來(lái)的不確定度urelx3

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用200μL移液器移50μL供試品及200μL水進(jìn)行樣品稀釋。根據(jù)檢定報(bào)告200μL移液器允許誤差為±1.5μL，按照矩形分布，本次實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的相對(duì)不確定度為：

4.3 樣品溶液體積urelx4

樣品溶液體積總共為2mL，1000μL移液器移取2次至樣品瓶中得到，根據(jù)檢定報(bào)告1000μL移液器允許誤差為±4.0μL，按照矩形分布，因而帶來(lái)樣品體積不確定度為：

4.4 樣品重量urelx5

樣品重量稱(chēng)量不確定度來(lái)自天平稱(chēng)量重復(fù)性和天平校準(zhǔn)兩個(gè)方面，供試品稱(chēng)量與標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量為同一天平的同一量程，評(píng)定方法相同，樣品重量稱(chēng)量帶來(lái)的相對(duì)不確定度為（樣品的稱(chēng)樣量為2.2mg）：

4.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方和進(jìn)行合成，得到合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4.6 擴(kuò)展不確定度

取包含因子K=2，置信概率為95%，擴(kuò)展不確定度為：

4.7 不確定度報(bào)告

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)使用Lowry法測(cè)定樣品蛋白含量，平行測(cè)試3份取平均值報(bào)告結(jié)果為203μg/mg。取包含因子K=2，置信概率為95%時(shí)，檢測(cè)結(jié)果可表示為蛋白含量X=（203±7.4）μg/mg。

5 討論

5.1 影響蛋白含量測(cè)定不確定度的因素

不確定度是指在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于測(cè)量誤差的存在，對(duì)被測(cè)量值不能確定的程度。凡是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能造成實(shí)驗(yàn)誤差的因素均可能是不確定度的來(lái)源，分析時(shí)應(yīng)理清每個(gè)不確定度分量的因果關(guān)系，確保無(wú)遺漏。本實(shí)驗(yàn)中，不確定度來(lái)源主要涉及測(cè)量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的稱(chēng)量及稀釋、加樣體積。由檢測(cè)重復(fù)性引入的不確定度屬于A類(lèi)不確定度，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的稱(chēng)量及稀釋、加樣體積引入的不確定度屬于B類(lèi)不確定度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，樣品稱(chēng)量引入的不確定度最大，其次為檢測(cè)重復(fù)性，樣品加樣體積、樣品稀釋及標(biāo)準(zhǔn)品帶來(lái)的不確定度較小，標(biāo)準(zhǔn)品溶液引入的不確定度分量中，由標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引入的不確定度最大。樣品及標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量使用同一臺(tái)天平，而樣品稱(chēng)量引入的不確定度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)品，這與本實(shí)驗(yàn)中樣品質(zhì)量較小有關(guān)。

5.2 減少不確定度對(duì)測(cè)量結(jié)果影響的策略

為減少不確定度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，檢測(cè)過(guò)程中需選用與稱(chēng)量樣品重量精密度相匹配的電子天平，且確保天平在檢定有效期內(nèi)，稱(chēng)量室應(yīng)在相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域，設(shè)置專(zhuān)用天平臺(tái)，以最大程度減小由稱(chēng)量帶來(lái)的誤差。檢測(cè)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，使用經(jīng)檢定校準(zhǔn)合格的移液器、容量瓶、移液管，以降低重復(fù)性誤差。

不確定度的評(píng)定應(yīng)該是一份完整樣品檢驗(yàn)報(bào)告的一部分，任何檢驗(yàn)方法都不可避免的有不確定度的引入。不確定度的評(píng)價(jià)對(duì)檢測(cè)結(jié)果臨界值的判斷和檢驗(yàn)方法的確認(rèn)有十分重要的意義。