Microrna-34a靶向Sirt1調(diào)控IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡研究*

陳薊 劉弼 熊怡勝 黃雪晴

（暨南大學第二臨床醫(yī)學院深圳市人民醫(yī)院骨科，廣東 深圳 518020）

在骨關節(jié)炎（osteoarthritis,OA）研究中，已有越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)與關節(jié)炎的發(fā)生有千絲萬縷的聯(lián)系，Microrna-34a（miR-34a）是其中之一[1]。已有研究[2]表明，miR-34a通過調(diào)節(jié)細胞周期從G1期過渡到S期，有抗增殖作用，miR-34a同樣能由p53誘導，從而促進細胞凋亡和細胞周期阻滯。Sirt1基因亦是已被證實在OA發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[3]；然而miR-34a調(diào)控Sirt1在骨關節(jié)炎、軟骨細胞中的研究報道較少見。本實驗研究在IL-1β誘導的軟骨細胞模型中，miR-34a對Sirt1的作用及其對Bcl-2的表達影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone)；DAPI染色試劑盒（Sigma）；Lipofectamine 2000、RT-PCR試劑盒（Invitrogen）；miR-34a mimic（RiboBio）；Sirt1抗體、GAPDH抗體（Santa Cruz）；Bcl-2抗體（Bioss）；低溫高速離心機（Eppendorf）；DNA擴增儀（Biometra）。

1.2 實驗方法

1.2.1 C57BL/6J小鼠膝關節(jié)軟骨細胞的分離、純化、培養(yǎng)和刺激處理：無菌操作下取小鼠雙膝關節(jié)，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS）沖洗，剪取全部膝關節(jié)軟骨。在顯微鏡下去除關節(jié)囊周圍組織，并將軟骨組織與深層組織仔細分離。剪碎軟骨組織后用0.2%II型膠原酶消化4～6 h，離心去上清，培養(yǎng)基洗滌后再用含15%胎牛血清培養(yǎng)液分散培養(yǎng)。隨機分為兩組，正常對照組與IL-1β組，IL-1β終濃度為100 ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，在加入IL-1β后24 h進行觀察和檢測。

1.2.2 DAPI染色與流式細胞術觀察軟骨細胞凋亡：取第2代軟骨細胞，調(diào)整密度為2×105/ml，接種于6孔板進行爬片。IL-1β組和對照組分別干預，24 h后按照DAPI染色試劑盒及AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作，觀察細胞凋亡情況。

1.2.3 熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C：分別構(gòu)建包含miR-34a種子序列結(jié)合位點野生型質(zhì)粒、包含種子序列突變位……