塞來昔布對急性出血壞死性胰腺炎炎癥介質的影響

李明軒，辛　辰，王忠瓊，△（.西南醫科大學臨床醫學院，四川瀘州646000；.西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000）

重癥急性胰腺炎（SAP）是臨床常見的急腹癥，其起病急、病情重、進展快、病死率高、預后相對較差。近年來的研究表明，促炎性細胞因子及炎癥介質介導的炎癥級聯反應在急性胰腺炎（AP）發生、發展中發揮著重要作用，在胰腺局部和胰腺外臟器功能的損害中扮演重要角色，與全身炎癥反應綜合征（SIRS）乃至多器官功能不全的發生、發展密切相關[1]。塞來昔布（Celecoxib）是新一代的非甾體解熱、鎮痛、抗炎藥物，其可選擇性抑制環氧化酶2（COX-2）的生成和活性，使得前列腺素類物質的合成與釋放減少，尤其是前列腺素E2的抑制作用，從而發揮生物學效應。本研究擬采用急性出血壞死性胰腺炎（AHNP）大鼠模型，觀察其血清中炎癥介質的動態變化，并觀察COX-2特異抑制劑Celecoxib的干預效應，期望對臨床治療AHNP提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實驗材料健康成年SD大鼠，體重100～150 g，由西南醫科大學動物實驗中心提供。L-精氨酸購自Sigma公司，Celecoxib購自Searle公司，血清一氧化氮（NO）測試盒（硝酸還原法）購自南京建成生物工程研究所，腫瘤壞死因子α（TNF-α）放射免疫測試盒購自解放軍總醫院東亞免疫技術研究所，BET-32M內毒素測定儀購自天津大學無線電廠。

1.2方法

1.2.1實驗分組將36只SD大鼠隨機分為對照組（S組）、AHNP組和Celecoxib預處理組（C+AHNP組），每組 12 只，觀察 4 個時相點（3、6、12、24 h），每個時相點3只。實驗開始前12 h，三組大鼠均嚴格禁食，但不禁飲。AHNP組：10%戊巴比妥（4 mL/kg）腹腔注射，選擇中上腹正中切口開腹，暴露胰腺和十二指腸，依次找到肝門、膽總管，并用動脈夾夾閉，使用4號半針頭穿刺進入膽胰管，距離約0.5 cm，以250 mg/kg的劑量緩慢注入20%的無菌L-精氨酸，并立即夾閉遠端膽胰管，數分鐘后可見胰腺組織充血、腫脹，松開動脈夾使膽胰管復通，立即用紗布壓迫穿刺孔，查無膽漏后關腹。S組：經膽胰管逆行注射等量滅菌生理鹽水，其他操作同AHNP組。C+AHNP組：用滅菌注射用水配制成1.0%的Celecoxib溶液，充分混勻后，以100 mg/kg劑量在誘導AHNP前1小時灌胃，其他操作不變。在相應時相點處死大鼠。

1.2.2樣本收集及處理

1.2.2.1血液樣本處死大鼠前心臟采血5 mL，以2 000 r/min離心，取得上清液即血清1.5～2.0 mL，-20℃冰箱中保存備用。每組自然死亡大鼠不行上述步驟。

1.2.2.2血清NO測定采用硝酸還原酶法測定血清NO水平，按操作說明依次加入試劑后，混旋均勻，室溫下靜置15 min，蒸餾水調零，上機檢測（540 nm，0.5 cm光徑）各管吸光度值（OD值）。計算公式如下：

1.2.2.3血清TNF-α檢測采用放射免疫分析法（RIA）。使用放射測定儀計數放射性核素標記的汞-鉛，即cpm值，通過劑量反應曲線（標準曲線）得出樣本抗原含量，cpm值與樣品內測定抗原濃度呈負相關。

1.2.2.4血清內毒素測定根據內毒素與鱟試劑反應產生凝膠的原理，采用動態濁度法定量檢測血清內毒素含量，通過生成凝膠的時間（臨界時間，T）來反映內毒素水平。方法如下。（1）實驗準備：為了除去可能存在的外源性內毒素，使用250°干烤實驗器具，時間為2 h。（2）標準曲線的繪制：準備1支20 EU細菌內毒素標準品，精確加入1 000μL單層分子水（BET），振蕩混勻15 min，使濃度為20.0 EU/mL，依次稀釋成內毒素標準溶液，濃度分別為 4.00、1.50、0.50、0.05 EU/mL，每一個濃度組分別吸取250μL于反應試管中，并加入1 500μL鱟試劑，混合均勻，快速插入內毒素儀檢測孔，測定T。每一濃度作2個平行試管，設置BET為陰性對照。（3）實驗曲線的繪制：取大鼠血漿1 500μL，并加入200μL生理鹽水和200μL Tris-HCl緩沖液混勻，100℃水浴鍋加熱共8 min，3 000 r/min離心8 min，取上清液200μL，加入200μL鱟試劑中，其濃度為0.5 EU/mL，混合均勻后迅速插入內毒素儀檢測孔，測定T，每一濃度作2個平行試管。

1.3統計學處理應用SPSS24.0統計軟件進行數據分析，計量資料以表示，采用t檢驗；獨立樣本采用Mann-Whitne檢驗及多樣本非參數比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1各組大鼠血清NO水平的動態變化S組大鼠血清NO水平在3、6 h較高，6 h后緩慢下降；AHNP組大鼠血清NO水平呈逐漸增高趨勢，12 h前緩慢上升，12 h后明顯增高；在3、6 h均明顯低于其余兩組，12 h的水平與S組相近，但24 h的水平明顯高于S組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；C+AHNP組大鼠血清NO水平在3、6 h與S組相近，但顯著高于AHNP組，12 h后達到高峰，隨后下降，在24 h與S組接近，同時顯著低于AHNP組。三組24 h的NO水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1　各組大鼠各時相點血清NO水平比較（±s，μmol/L）

表1　各組大鼠各時相點血清NO水平比較（±s，μmol/L）

注：與 S 組比較，aP＜0.05；與 AHNP 組比較，bP＜0.05

組別3 h 6 h 12 h 24 h S組AHNP組C+AHNP組n　3　3　3 NO 36.60±3.97 18.86±4.41a35.69±9.81bn　3　3　3 NO 38.30±3.20 24.70±1.62a38.60±4.84bn　3　3　3 NO 34.68±4.14 35.81±1.43a63.06±1.99bn　3　3　3 NO 31.84±1.28 47.85±0.23 33.61±7.38

圖1　各組大鼠各時相點血清NO的動態變化

2.2各組大鼠各時相點血清TNF-α水平動態變化AHNP誘導3 h后，血清TNF-α水平顯著增高，呈時間依賴性；而C+AHNP組在各個時相點有所降低，但是其作用強度逐漸加強，6 h最強，12 h后逐漸減弱，見圖2。與S組比較，AHNP組大鼠各時相點TNF-α水平明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而C+AHNP組大鼠各時相點TNF-α水平明顯低于AHNP組，但僅6、12 h時差異有統計學意義（P＜0.05），3、24 h時差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2、圖3。

表2　各組大鼠各時相點血清TNF-α水平比較（±s，ng/mL）

表2　各組大鼠各時相點血清TNF-α水平比較（±s，ng/mL）

注：與 S組比較，aP＜0.05；與 AHNP 組比較，bP＜0.05

組別S組AHNP組C+AHNP組3 h 6 h 12 h 24 h TNF-α 0.47±0.10 2.73±0.17a1.90±0.22n3 3 3 TNF-α 0.45±0.08 1.85±0.14a1.46±0.38n3 3 3 TNF-α 0.47±0.10 2.17±0.11a1.13±0.08bn3 3 3 TNF-α 0.44±0.10 2.61±0.09a1.47±0.22bn3 3 3

圖2　C+AHNP組降低大鼠血清TNF-α水平的動態變化

圖3　各組大鼠血清TNF-α水平的動態變化

2.3各組大鼠血清內毒素水平的變化使用線性回歸法分析內毒素標準品濃度與反應T，設計標準曲線方程為：lgT=2.835 02+（-0.250 96 lgN），相關系數（r）=-0.996 3（要求r＜-0.98），顯示內毒素在 0.04～5.00 EU/mL，與 T 呈線性關系。AHNP組血清內毒素水平持續升高，尤其12 h后上升最明顯，S組與AHNP組各時相點內毒素水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），C+AHNP 組與AHNP組各時相點內毒素水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3、圖4。

表3　各組大鼠各時相血清內毒素水平變化（±s）

表3　各組大鼠各時相血清內毒素水平變化（±s）

注：與S組比較,aP＜0.05

組別S組AHNP組C+AHNP組S組AHNP組C+AHNP組S組AHNP組C+AHNP組S組AHNP組C+AHNP組n3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3時相點3 h 6 h內毒素水平（10-5EU/mL）5.67±0.19 61.94±8.04a54.98±3.81 5.58±0.51 222.82±40.99a249.61±12.95 6.40±0.47 276.57±29.39a222.70±83.68 5.92±0.45 995.24±161.59a847.73±31.92 12 h 24 h T（s）7 957.86±67.343 4 372.89±142.901 4 501.55±79.847 7 997.39±81.442 3 178.98±145.402 3 078.59±40.814 7 724.31±143.321 3 004.21±86.176 3 152.24±28.227 7 874.56±147.339 2 182.53±86.920 2 250.17±38.044

圖4　各組大鼠血清內毒素水平比較

3　討　論

AP起病后體內胰酶、細胞因子及炎癥介質大量釋放，形成SIRS，抗炎性細胞因子同步產生，促炎-抗炎平衡紊亂，胰腺彌漫性出血和組織壞死，最終導致病情不斷惡化[2]。有研究認為，各種細胞因子并非直接發揮作用，而是通過調節COX-2的表達來啟動炎性反應[3]。因此，如果抑制COX-2，就有可能改變AP體內的炎癥介質的表達，改善患者預后。

NO參與血管炎性反應、免疫反應，并與炎癥免疫細胞因子相互調節。AP是多種免疫細胞參與的炎癥免疫反應。生理劑量的NO可以舒張血管平滑肌，增加維持胰腺血流灌注，抑制血小板聚集等，而過量的NO直接導致血管難治性擴張，胰腺灌注減少，加重胰腺組織損傷。此外，NO也有增加血管通透性的作用，與組織水腫有一定的關系[4-7]。可見，在AP的病情進展中，NO表現出雙重生物學行為[8-10]。本研究觀察了AHNP造模后3、6、12、24 h大鼠血清NO水平的動態變化，結果發現在3、6 h，AHNP組明顯低于S組，但隨后上升顯著，于12 h與后者持平，并繼續增高，在24 h顯著高于S組，呈現先降低后升高的現象。C+AHNP組在3、6 h與S組血清NO水平十分接近，12 h明顯增高，隨后逐漸下降，24 h接近后者，呈現先升高后降低的雙相變化，提示Celecoxib可通過調節NO水平，顯著改善微循環，增加組織血流灌注，減輕缺血、缺氧性損傷，改善全身炎性反應和器官組織損傷。

TNF-α激活巨噬細胞并促進其釋放，在炎癥級聯放大效應中發揮主要作用，是導致AP并發SIRS的主要促炎性細胞因子。其結果是引起代謝亢進、微血管損傷、血流動力學障礙等一系列病理生理改變，甚至導致器官衰竭[11-15]。本研究結果顯示，AHNP誘導后3 h，血清TNF-α水平即顯著增加，并呈進行性增高趨勢；而Celecoxib預處理后各時相點血清TNF-α水平均顯著降低，其中以3、6 h的作用強度較高，表明Celecoxib有助于改善全身炎性反應、下調器官功能損傷。

有研究發現，在SAP發病早期，因全身大量炎癥介質、細胞因子的釋放，腸道黏膜屏障功能受損，腸源性內毒素移位，形成內毒素血癥，對血管內皮細胞和巨噬細胞均具有損傷和活化作用，反饋激發更多炎癥介質的釋放，故內毒素是加重AP的重要因素[16-18]。本研究結果顯示，S組大鼠血清內毒素水平極低，僅有微量且動態恒定；在AHNP組造模后3 h，血清內毒素水平顯著增高，呈持續增高趨勢，尤其在12 h增高最為明顯，表明在SAP發病后相對較晚時期，內毒素發揮主要損傷作用。而在炎性反應的早期，內毒素水平無明顯變化，波動較小，因此，Celecoxib對AP后內毒素水平無明顯影響，但是否通過激活某種細胞內信號轉導通路發揮抗炎作用，尚需進一步研究。

綜上所述，Celecoxib在AHNP中具有抑制TNF-α、雙向調節NO等炎癥介質的轉錄與釋放作用，是AP治療的新思路。