對無菌生產潔凈環境驗證與監控的討論

陳王露，陳青青，孫志勇，汪霄峰，戴志芳

（浙江惠迪森藥業有限公司，浙江杭州 311400）

藥品作為一種特殊的商品，需要通過各種控制手段確保其有效性、穩定性和安全性。在藥品有效性的前提下，安全性是至關重要的，對于無菌藥品，無菌性是影響藥品安全性的關鍵控制指標。無菌性的保障需要從整個生產過程進行全程控制，包括人員、設備、物料、環境、程序方法建立無菌控制策略。本文從環境控制策略角度來分別闡述無菌藥品生產的潔凈環境的驗證和日常監控的流程和關鍵控制點。

HVAC系統通過空氣凈化過濾單元，去除空氣中的微粒子、細菌，從而達到藥品生產所需的環境。HVAC系統的組成包括潔凈氣體處理單元、熱源、冷源等多個部分組成，如圖1所示[1]。

1 潔凈環境的驗證

潔凈廠房與空調凈化系統驗證和其他設備和設施的驗證一樣，客戶需要在概念設計階段提出書面的用戶需求說明，并在項目設計、施工、調試驗收過程中不斷審核及更新。

供應商根據用戶需求說明和詳細的調研進行系統設計，再根據用戶需求說明、技術文件、設計院施工圖、二次深化設計圖紙和相關施工說明文件進行設計確認，設計確認的形式多樣化并不固定，會議紀要、參數計算書、技術交流記錄、郵件等都是設計需確認的證明文件。設計確認一般包括對用戶需求說明的審核確認和對GMP要求的符合確認。設計確認是一個動態的過程，應隨著設計文件的不斷澄清和細化逐漸深入進行[2]。

建設項目竣工后進行安裝確認，目的在于檢查并證明潔凈廠房與空調凈化系統中各組件自身以及裝備關系、裝配結果符合用戶需求說明和施工設計文件的規定，如果在建設過程中在任何項目更改了原設計文件中所規定的指標，應有設計變更的批準文件。本文重點將對潔凈廠房的運行確認和性能確認進行詳細的描述。

圖1 HVAC系統的組成

1.1 運行確認

在運行確認之前，需草擬出潔凈廠房和空調凈化系統的標準操作規程，測試過程中使用到的儀器應滿足儀器校準合格要求。

運行確認開始需要檢查相關文件是否符合要求，包括安裝確認是否完畢，文件是否已經審批結束；草擬的SOP是否已經存在并已經批準；測試過程的SOP是否已經存在并執行。

運行確認的測試項目包括：（1）互鎖門功能檢查；（2）房間內照度測試，確認房間內的照度符合設計的要求；（3）房間內噪音的測試，確保房間內在靜態和動態情況下符合設計的要求。

1.1.1 風量和換氣次數測試

確認房間的換氣次數和風量符合設計的要求。風量測試一般采用風量罩風速測試一體的測試儀，通過測試面風速，計算送風量。換氣次數通過測試單位時間內的送風量，結合房間的體積計算換氣次數。

房間換氣次數按式（1）來計算：

式（1）中，n為房間換氣次數（次/h），L1、L2、……Ln為房間n個高效送風口風量（m3/h），V為房間體積（m3）。對于含有層流的房間，在算定房間換氣次數時房間體積應扣除層流體積。

1.1.2 風速的測試

單向層流設備的風速應滿足A級潔凈區風速的要求。新版GMF附錄1《無菌藥品》中規定，A級為高風險操作區，如灌裝區、放置膠塞桶和與無菌制劑直接接觸的敞口包裝容器的區域及無菌裝配或連接操作的區域，應用單向流操作臺（罩）維持該區的環境狀態；單向流系統在其工作區域必須均勻送風，風速為0.36～0.54 m/s（指導值），應有數據證明單向流的狀態并經過驗證[3]。

風速的測試項目和氣流流型測試應該互相結合和驗證，保證工作區域在一定風速的要求下，氣流流型符合單向流的要求，一般可以用煙霧實驗錄像來證明。

風速的測試還包括了風速的均勻性要求，送風均勻性不好的單向流潔凈區需要更高的送風速度才能維持所需求的潔凈度，從而增加運行能耗。

風速測試的方法為主過濾器或擴散板下游100 mm處的平面的面積分成不得少于十二等分的面積，各面積中心點即為風速測點(見圖2風速測試點)。但各測點間距不應大于25 cm。將各測點風速值計算出截面風速算術平均值：

風速均勻率按式（3）計算：

式中，p為風速的均勻率（%）；Vmin/max為測點中最大或者最小風速（m/s）；Var為風口處測得的平均風速（m/s）。

圖2 風速測試點

1.1.3 房間壓差測試

確認每個房間和外界的壓差，與相鄰或者相隔房間的壓差符合設計和GMP的要求。一般使用離線的壓差計或在線的HVAC自控系統進行確認。

1.1.4 溫濕度測試

確保每個房間在靜態和動態情況下溫濕度符合設計的要求。目前，GMP并沒有對房間的溫濕度要求作出明確的規定，一般結合產品的生產工藝和人員的舒適度，盡量減少污染、交叉污染的可能性。

1.1.5 高效過濾器完整性檢測

過濾器主體、過濾器邊框以及安裝邊框必須保證密閉完好，防止任何微粒通過旁路泄露到下游。

高效過濾器的完整性測試一般采用計數器測試法和氣濃膠光度計法，目前氣濃膠法的應用比較普遍。在過濾器的上游釋放PAO氣濃膠煙霧，上游濃度一般保持在20～80 mg/m3，在下游通過光度計的采樣頭以一定的速度逐行掃描過濾器的主體和邊框的穿透出的PAO氣濃膠的濃度，采樣頭的掃描速度應根據采樣頭尺寸確定。H14的過濾器要求主體泄漏率≤0.005%，邊框泄漏率≤0.01%。

1.1.6 氣流流型的測試

對于亂流的潔凈室，氣流流型應該明確標識出房間的氣流從出風口送出，經過房間的亂流形式，最終從回風口離開房間的整體趨勢。

對于單向流的設備，氣流流型需要明確的顯示出單向流的形態：氣流方向為直線型，各點風速均勻，沒有死角和湍流。

氣流流型一般采用煙霧發生器在出風口進行發煙，觀察氣流流型，并用攝像機對過程進行攝像，刻錄光盤后和驗證文件一起存檔。

1.1.7 潔凈級別的確認

根據中國2010版GMP無菌附錄的要求，不同的生產工藝需要在相應的潔凈級別中進行，潔凈級別分為4個等級。（1）A級：高風險操作區，如灌裝區、放置膠塞桶和與無菌制劑直接接觸的敞口包裝容器的區域及無菌裝配或連接操作的區域，應當用單向流操作臺（罩）維持該區的環境狀態。單向流系統在其工作區域必須均勻送風，風速為0.36～0.54m/s（指導值）；應當有數據證明單向流的狀態并經過驗證；在密閉的隔離操作器或手套箱內，可使用較低的風速。（2）B級：指無菌配制和灌裝等高風險操作A級潔凈區所處的背景區域。（3）C級和D級：指無菌藥品生產過程中重要程度較低操作步驟的潔凈區。各級別空氣懸浮粒子的標準規定見表1。

表1 各級別空氣懸浮粒子的標準規定

運行確認中的潔凈級別確認應該在靜態條件下進行，按照ISO-14644-1中的詳細流程進行潔凈級別的確認，檢測結果應該符合各級別的粒子標準要求[4]。

1.1.8 自凈時間測試

自凈時間測試常用的方法為100∶1的自凈時間測試法，也就是環境從動態轉變為符合靜態要求情況下所需要的時間。先通過發塵的方式把房間內的粒子濃度達到該房間靜態級別粒子濃度的100倍，也就是動態級別的要求（除D級區以外），然后通過房間內空調系統的空氣置換，測試粒子濃度，計算粒子濃度下降100倍所需要的時間，即為該房間的自凈時間。自凈時間的結果可以用于日常環境控制的一個重要數據來源。

1.2 性能確認

性能確認一般包括靜態和動態兩種狀態下的測試，一般由客戶自己執行。

靜態測試過程中，除了空調系統、設備層流系統開啟外，其他的設備均已安裝就緒，但沒有生產活動且無人操作的房間狀態，考慮測試和調試人員，一般要求一個房間內的人員不能超過兩個。靜態測試前，已經確認空調系統的運行模式，空調系統的操作程序已經獲得批準并且執行,OQ已經完成并完成問題的整改和文件的審批。

動態測試在靜態測試完成后，連續進行動態測試，動態測試過程中需要有生產活動，可以是模擬的生產活動，房間內按照正常最大人數的操作人員進行安排，必要時可以和培養基灌裝驗證同步進行動態測試。

性能確認的內容包括壓差測試、溫濕度測試、懸浮粒子測試、微生物項目的測試。微生物的監測項目包括接觸碟、沉降菌、浮游菌。懸浮粒子和微生物的監測取樣點應該結合風險評估確認最差條件的取樣點進行監測[5]。

2 環境的日常監控

環境的日常監測在環境性能確認動態測試后開始進行，結果同時可以作為潔凈廠房的定期回顧性驗證。日常環境監控策略中需要包括監測點、監測頻率、監測方法、監測標準、監測結果的處理等關鍵內容。

2.1 監測點確認

按照中國2010版GMP的要求，日常環境監測點的確認需要結合風險評估來確定，一般包括采用性能確認時的最差點、結合工藝評估的風險最高點確定日常監測的采樣點數量，同時需要考慮廠房設施、生產線的設定、生產工藝、歷史數據、測試方法等。測試點不能更多地增加生產的污染風險，在確定取樣點時可以考慮以下問題：（1）在哪些點最有可能造成微生物的污染（包括生產活動的頻率、清潔消毒最不能覆蓋的地方等因素）；（2）取樣點在生產過程中最有可能發生最嚴重的微生物污染的繁殖；（3）什么樣的活動會導致污染的擴散。

2.2 監測頻率確認

關于監測頻率，中國2010版GMP中有如下的規定，（1）在關鍵操作的全過程中，包括設備組裝操作，應當對A級潔凈區進行懸浮粒子監測。生產過程中的污染（如活生物、放射危害）可能損壞塵埃粒子計數器時，應在設備調試操作和模擬操作期間進行測試。A級潔凈區監測的頻率及取樣量，應能及時發現所有人為干預、偶發事件及任何系統的損壞。灌裝或分裝時，由于產品本身產生粒子或液滴，允許灌裝點≥5.0 μm的懸浮粒子出現不符合標準的情況。（2）在B級潔凈區可采用與A級潔凈區相似的監測系統?？筛鶕﨎級潔凈區對相鄰A級潔凈區的影響程度，調整采樣頻率和采樣量。

除了法律的規定以外，公司可以參考相關的指導原則來確定取樣頻率，從風險分析的角度考慮，根據潔凈區的重要性來確定。同時結合趨勢分析回顧來評估取樣頻率的合理性，以保證監測行為的有效性。

2.3 監測方法

監測可以按照ISO14644中詳細的測試標準流程進行。懸浮粒子的監測方式包括離線監測和在線監測，采用標準的粒子計數器進行監測。粒子監測需要采用等動力學探頭，避免采樣對周圍的氣流流型造成影響，或者造成粒子在管路內的沉積。

浮游菌采用浮游菌采樣儀進行監測，一般采用直徑90 mm的培養皿培養，采樣方式包括了夾縫式和撞擊式采樣。沉降菌的采樣方式為被動式，將90 mm直徑的培養皿暴露在工作臺面，監測4 h，培養觀察監測結果。

表面微生物監測的方法一般包括直接擦拭法（適用于平整易清潔消毒的表面）、棉簽擦拭法（適用于非平整的表面）、表面沖洗法（一般適用于不能被擦拭到的表面，如管路、罐體等）。

2.4 監測標準

監測的標準一般包括法定限度、行動限度和警戒限度。法定限度是根據國際標準、GMP等要求建立。行動限度根據歷史數據以及環境的風險評估來制定，由企業自己建立，但不得高于標準限，一般可以參考歷史數據平均值的3倍或6倍相對標準偏差來制定。警戒限度根據歷史數據以及環境的風險評估來制定，由企業自己建立，但是不得高于行動限，一般可以參考歷史數據平均值加2倍或者3倍相對標準偏差來制定。行動線和警戒線不是固定不變的，應該根據具體的情況進行調整，如季度或者年度的監控結果趨勢分析。

對監測標準的設定有以下幾點注意事項：（1）在沒有大數據庫的情況下，行動限和標準限設置可以是一致，但需要定期的回顧其合理性；（2）警戒線可以設置為行動限的一半，但需要對年度的數據進行回顧，參考UCL值來進行評估警戒線的合理性；（3）A級區微生物監測標準為＜1，代表不得檢出菌，如果檢出，需要對產品進行調查和嚴格的評估；（4）A級送風環境應符合靜態A級標準，動態應根據生產環境的性質制定動態的相應標準；（5）微生物限度法規只有動態監測的標準，需要根據企業生產環境的要求建立自身的靜態標準；（6）每個限度都是有單位的，制定標準時需要和采樣量、單位一并考慮。

2.5 監測結果的處理

對于日常環境監測的數據需要進行及時的統計，并定期進行趨勢分析和結果分析，趨勢分析的結果用于分析監測頻率、監測標準的合理性。監測結果一般出現超過行動線，或者一日多點或者單點多日連續超過警戒線時，需要啟動原因調查，并制定合理的糾正措施，如有必要需要增加預防措施。

調查超標原因時一般需要從人機料法環各方面進行調查，對相應的超標菌需要進行鑒別，并且需要對糾偏措施進行回顧，評估其有效性[6]，并對該超標結果造成的對產品的影響進行評估。

3 結語

本文論述了潔凈廠房的驗證過程以及日常環境監測的基本制定策略，潔凈環境是確保無菌產品生產的重要影響因素。在制藥技術發展的同時，企業應該更加關注國內外的各種GMP的法規、標準、指南中對潔凈廠房和空調系統的要求的不斷更新。

制藥企業也可以嘗試更加先進的監測和控制技術，例如在線粒子監測、在線微生物監測、HVAC自動控制系統（EMS和BMS）等。有利于更好地控制無菌產品生產的潔凈環境，并快速和準確的獲得監控的結果[7]。

[1]陸亞俊.暖通空調[M].建筑工業出版社,2005:25-60.

[2]何國強.制藥工藝驗證實施手冊[M].北京:化學工業出版社,2012:50-75.

[3]國家藥品監督管理局.藥品生產質量管理規范(2010年修訂)[Z].衛生部令第79號,2011.

[4]ISO 14644 Cleanrooms and associated controlled environments,Biocontamination control[S].Switzerland:ISO,2015.

[5]ISO 14698 Cleanrooms and associated controlled environments[E].Switzerland:ISO,2015.

[6]范一靈.無菌藥品生產企業核心區微生物污染調查與分析[J].中國藥事,2014,6(2):586-590.

[7]崔菊霞.無菌操作技術在無菌制劑生產中的應用[J].中國藥事,2013,27(2):158-162.