翟東改，陳凌，錢平

（江蘇蘇青生物技術有限公司，江蘇無錫 214000）

抗體是由抗原刺激而產生，并能與刺激其產生的抗原發生特異性結合的具有免疫功能的糖蛋白[1]。通常把血清或血漿中的抗體成分稱為免疫球蛋白（Ig），不同的重鏈和輕鏈組成完整的Ig分子，分別為IgM、IgG、IgA、IgD和IgE等。抗體藥物的生產由于其生物料液的復雜性以及對抗體產品要求的嚴格性使抗體純化過程成為了抗體生產的關鍵，該純化過程約占抗體藥物生產成本的50%～80%。抗體的分離純化一般分為樣品的粗提、粗提物精制、抗體精純三個步驟[2]，抗體生產的基本流程如圖1所示。

圖1 抗體生產基本流程步驟[3]

常規的抗體分離純化方法有鹽析法、超濾法、色譜層析分離法等，其中色譜層析方法在抗體純化過程中應用比較廣泛，主要包括離子交換層析、疏水層析、親和層析、凝膠過濾等。親和層析由于其高選擇性、特異性，成為抗體純化非常有效的方法之一，同時可以減少純化步驟，縮短純化時間。

1 常規分離方法

1.1 鹽析法

根據不同的蛋白質的疏水性特點，提高鹽濃度、增加其疏水性，從而使蛋白沉淀。影響鹽析的主要因素為溫度、pH、樣品濃度。通常鹽析法作為抗體的粗提技術，要想獲得高純度的抗體需要與其他的色譜方法結合。

1.2 超濾法

超濾技術是20世紀70年代興起的一種新的分離技術，該技術成本及能耗低，操作條件溫和，特別適用于活性分子的提取。但隨超濾的不斷進行，膜容易出現污染，需要定期的進行膜清洗，另外在超濾過程中蛋白容易發生聚集。

2 色譜層析方法

2.1 離子交換色譜

利用離子交換劑為固定相，根據荷電溶質與離子交換劑之間的靜電相互作用力的差別進行溶質分離[4]。通過調節緩沖液及樣品的pH，使抗體帶上電荷，與帶相反電荷的介質結合，結合在介質上的抗體分子可通過改變洗脫緩沖液的pH或者鹽濃度而洗脫下來。離子交換色譜的吸附性能取決于樣品的鹽濃度，鹽濃度過高抗體無法吸附，因此需預先對原料液除鹽，降低鹽濃度后才可以上柱。另外，過高或者過低pH也容易引起抗體的活性喪失。

2.2 凝膠過濾

根據料液中溶質相對分子量的差別進行分離，但是其具有選擇性低，料液的處理量小（5%CV）等特點，因此常作為精制步驟。

2.3 疏水層析

根據蛋白質與疏水性吸附劑之間疏水相互作用的差別進行蛋白質類生物大分子分離。一般是高鹽吸附、低鹽洗脫。抗體由于其分子中有許多非極性氨基酸（色氨酸、酪氨酸、丙氨酸等），暴露于抗體分子表面的非極性氨基酸側鏈可以密集在一起形成疏水區[5]，疏水區與吸附劑結合，達到純化抗體的目的。

2.4 疏水電荷誘導色譜

疏水電荷誘導色譜（HCIC）的吸附機理是基于對偶模式的離子化配基的pH依賴的行為，配基同時包括疏水基團和弱離子化基團。流動相的pH值在6～9的范圍內，配基不帶電，配基和間隔臂作為疏水位點，并且通過疏水作用結合蛋白，因此不需要加入鹽即可實現對蛋白的吸附。當降低流動相的pH值，配基帶上正離子電荷，此時蛋白質也帶上凈正電荷，由于蛋白質和配基之間的靜電排斥作用而發生解吸。最早的吸附劑為Pall公司提供的MEP HyperCel（4-巰基乙基吡啶）。Guerrier等[6]通過MEP HyperCel一步層析分離操作，從腹水或含5%牛血清的細胞培養液中有效捕獲抗體，純度分別達到83%、69%，IgG的動態載量達25～35mg/mL介質[7]。

2.5 親和層析

親和層析利用功能分子特定的結構與生物分子可逆的特異性相互識別并結合。常見的結合類型為酶與底物、抗原與抗體。由于其高度的特異性及同時具有濃縮的效果，已廣泛用于從大量的復雜溶液中分離少量的特定蛋白質，如抗體。

2.5.1 親和層析基質

親和層析是基于抗體分子和偶聯在固相基質上的親和配基之間的特異性識別實現抗體純化，用于固定配體的固相基質分為天然的固相基質（如瓊脂糖、葡聚糖、纖維素）、化學合成的固相基質（如丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯）、無機骨架固相基質（如多孔硅膠、玻璃纖維）。親和基質的種類及市售代表產品見表1。在過去的幾十年中，磁珠作為親和分離基質備受關注，在1970年逐漸應用到化學，制藥及生物技術領域。

2.5.2 配基

目前，抗體親和純化介質常用的配基主要有生物活性配基、合成配基、親和仿生配基。

2.5.2.1 生物活性配基

主要有天然蛋白，如蛋白A、蛋白G、蛋白L、凝集素、抗原等。

（1）蛋白A于1940年第一次被Verwey從金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）細胞壁中分離，是一種能與人及多種哺乳動物血清免疫球蛋白分子發生非特異性結合的蛋白質。野生型蛋白A基因編碼序列由1464個堿基組成（不包括編碼N端信號肽的108個堿基），共編碼488個氨基酸，分子量約為42 kD。蛋白A從N端至C端依次由S、E、D、A、B、C、X結構域組成。單個結構域均具備結合抗體Fc片段和VH3亞類抗體Fab片段的能力。

（2）蛋白G來源于化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的細胞壁蛋白[17]。蛋白G和免疫球蛋白IgG有較強的結合。與多數哺乳動物的IgG的Fc段結合，與Fab段也有氫鍵的相互作用，但不結合人IgM、IgD和IgA，與蛋白A相比，具有更廣的IgG結合能力。

（3）蛋白L是從消化鏈球菌（Peptostreptococcusmagnus）中分離出來的蛋白[18]。對于抗體可變區域的Kappa輕鏈片段（Kappa light chain）有很強的親和力，能夠與免疫球蛋白的k1、k3和k4輕鏈結合，但不與k2和L輕鏈（Lambda lightchain）結合，適合于純化免疫球蛋白的片段，如scFv、Fab、F(ab')2等。目前沒有發現蛋白L可以與抗體的Fc段及重鏈結合。蛋白L結合抗體的種類范圍比較寬，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD，可以識別50%的人及75%的鼠免疫球蛋白。天然配基及與抗體的結合位點見表2。

表1 親和基質的分類

表2 天然蛋白配基與抗體的結合位點

（4）凝集素（lectin）是一種從植物或動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白，可以與抗體的糖基化位點特異可逆的結合，因此被用來純化抗體。常用的如伴刀豆球蛋白A（ConA）、小麥胚芽凝集素（WGA）、甘露聚糖-結合蛋白（MBPs）。凝集素一般用來純化IgD、IgA、IgM，通常中性pH條件下結合，中性條件0.1～0.5M鹽濃度下洗脫[22]。最常用的伴刀豆親和介質在pH7.4條件下對抗體的動態吸附載量最高，在2M鹽濃度下90%的抗體可以被完全洗脫，而且在使用10個循環以后，捕獲IgG的能力不變[23]。

（5）抗原或者抗體作為配基，整個抗原作為配基的親和介質可純化抗體，特異性的肽段作為親和配基也可以純化抗體同時模擬抗原的結構或序列的配基也可以實現抗體純化，但是需要篩選其親和性能，而且要進一步優化抗體的洗脫條件。單結構域抗體（sdAb）由于其分子量小，高親和性及穩定性通常用于抗體純化，但是sdAb其載量較低，因此在純化工藝中比較受限。

2.5.2.2 合成配基

TAC（Thiophilic adsorption chromatography）又稱親硫色譜、嗜硫色譜。嗜硫色譜介質上配基砜-硫醚基團在一定濃度鹽濃度條件下（通常為硫酸鹽和磷酸鹽），可與抗體表面適當的位點相互作用，通過降低鹽濃度洗脫抗體，對抗體和巨球蛋白具有顯著的親和吸附性。Porath在1985年首次用嗜硫色譜從血清中分離出抗體。最早的TAC吸附劑為T-GEL，是瓊脂糖經過二乙烯砜（DVS）活化再與2-巰基乙醇（2-ME）作用生成砜-硫醚基團，對IgG的吸附容量為18～28g/L。嗜硫色譜已廣泛應用于牛IgG抗體[24]、雞蛋IgY、F(ab’)2、Fab片段以及大腸桿菌scFvs[25]。另外，磁珠經DVB和VAC處理后，偶聯雜環配基如2-羥基吡啶純化人血清中的抗體，抗體純度＞94%，生物活性＞99%[26]。

HAC羥基磷灰石層析（hydroxyapatite chromatography，HAC）是以羥基磷灰石為介質的層析分離技術。羥基磷灰石的分子式為Ca10(PO4)6(OH)2，是一種含鈣礦物質。羥基磷灰石上的2個作用位點，其中帶負電的PO4的位點可以與帶正電的蛋白質以離子鍵結合，具有離子交換的特性，可采用鹽濃度梯度洗脫；而帶正電Ca2+位點可與帶負電蛋白質的自由羧基以金屬螯合方式結合[27]。HAC與蛋白A、蛋白G一樣可一步純化IgG，也可以用于IgA、IgM的捕獲，載量10～20mg/mL，純度＞90%。通常在用鹽濃度梯度洗脫目標時時加入PEG，可更好的去除聚集體、宿主蛋白、DNA、內毒素以及病毒[28]。

IMAC固定化金屬螯合親和層析主要利用暴露的蛋白質殘基（組氨酸、賴氨酸、色氨酸等）和介質上的金屬離子（銅、鋅、鈷、鎳等）之間的相互作用不同而分離蛋白質。IMAC可以用來純化不同物種的抗體以及不同抗體的亞種，主要用于分離一些通過基因工程手段獲得的帶有氨基酸殘基的抗體片段，如scFv。IMAC的配基通常為NTA、IDA，中性條件下結合，通過改變pH或者競爭吸附（咪唑）進行洗脫。

硼酸親和層析主要是利用硼酸或其衍生物作為配基，與抗體Fc片段的多聚糖結合，完成抗體純化。硼酸親和具有低成本，高穩定性以及通過改變pH條件快速將抗體洗脫解離的優點。

2.5.2.3 親和仿生配基

隨著蛋白晶體解析技術的快速發展和計算機分子模擬技術的不斷進步，親和仿生配基技術得到了強有力的支撐，通過分子模擬對蛋白結構和潛在的配基結合位點進行分析，采用分子對接和分子動力學模擬等手段設計和篩選出潛在的配基[29]。目前，應用比較廣泛的親和仿生配基為化學合成仿生配基和短肽仿生配基。

化學合成仿生配基是通過化學方法合成親和仿生配基，分子量相對較小，與目標蛋白具有一定的親和性，而且能夠以共價鍵的形式偶聯到基質上。目前，化學合成配基主要為基于三嗪結構的配基[30-33]和多組分反應合成的配基[34-35]。Li等[33]以蛋白A作為模板，設計了基于三嗪類的仿生配基。通過分析蛋白A與IgG-Fc片段復合物的晶體結構，確定二者間的特異性識別位點，以關鍵殘基Phe132-Tyr133二肽作為模板設計仿生配基Ligand 22/8，將其偶聯到瓊脂糖基質上用于分離血漿中的抗體，吸附容量可達到50 mg/g介質以上，抗體收率大于60%，純度大于92%，且該介質可以在1mol/LNaOH中保存7天[30]。基于該配基的商業化介質MabSorbentA1P和A2P，已應用于單克隆抗體和Fc融合蛋白的分離純化，可以達到蛋白 A 親和層析的效果。

短肽仿生配基是以氨基酸作為原料，通過設計、篩選和優化保證與目標蛋白的親和性的小肽。分為線性肽、環肽、多聚肽配基。Yang等[36]在IgG的Fc片段構建了以N端開始依次為組氨酸-芳香族氨基酸-堿性氨基酸的六肽庫，利用組合化學進行篩選，得到了特異性結合Fc片段的六肽配基HWRGWV，可純化人、牛、鼠、羊、兔的IgG。Fassina等[37]通過篩選多聚肽庫，得到特異性識別IgG的Fc片段多聚肽，命名為TG19318。TG19318親和柱能在中性低離子強度緩沖液中吸附抗體，與從細胞培養上清獲得的原始料液的物化性質完全兼容，用pH3.0醋酸溶液或pH9.0碳酸氫鈉溶液調節緩沖液pH值至酸性或弱堿性，就能洗脫吸附的抗體。TG19318比蛋白A具有更廣泛的特異性，不僅能純化IgG，還能純化IgY、IgM、IgA和IgE。

3 總結和展望

抗體藥物迅猛發展，抗體的純化問題日益突顯，高效、低成本、高純度地獲得抗體成為最關鍵的步驟。現通用的蛋白A介質成本高，且不耐受苛刻條件，因此需開發經濟有效的純化方法。疏水電荷誘導層析由于其選擇性較好，洗脫條件相對溫和、價格低廉，而且初始樣品可不經預處理直接上柱，操作簡便，若大規模應用于抗體純化，會帶來很高的經濟效益。另外，短肽類仿生親和配基與生物親和配基具有相似的親和力，然而構象更加穩定，并且已成功應用于抗體純化。隨著計算機輔助技術及高通量篩選技術的進以及技術的推廣，仿生親和技術應用會越來越廣泛，抗體的低成本、高效率生產指日可待。

[1]沈萍.微生物學[M].北京:高等教育出版社,2000:401-408.

[2]劉生杰,余為一.免疫球蛋白IgG和IgM分離純化技術現狀與展望[J].阜陽師范學院學報,2006,9(3):27-31.

[3]N Kruljec, TBratkovic.Alternative Affinity Ligands for Immunoglobulins[J] Bioconjugate Chemistry,2017.

[4]董志偉,王琰.抗體工程[M].2版.北京:北京醫科大學出版社,2002.

[5]王旻.治療性抗體藥物研究與發展趨勢[J].藥物生物技術,2011,18(2):95-99.

[6]Guerrier L, Flayeux I, Boschetti E. A Dual-mode Approachto the Selective Separation of Antibodies and their Fragments[J].Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications,2001,755(1):37-46.

[7]Boschetti, E. Antibody Separation by Hydrophobic Charge Induction Chromatography[J]. Trends Biotechnol,2002,20(8):333-337.

[8]R. Axen, J. Porath, S. Ernback.Chemical Coupling of Peptides and Proteins to Polysaccharides by Means of Cyanogen Halides[J].Nature,214(1967):1302-1304.

[9]J. Turková, BioaffinityChromatography[J].Journal of Chromatography Library, Elsevier,1993.

[10]Jií??tamberg.BeadCellulose[J].Separation & Purification Reviews,1988,17(2):155-183.

[11]A，Verdoliva；，Pannone；M，Rossi et al. Affinity Purification of Polyclonal Antibodies using a New all-D Synthetic Peptide Ligand:Comparison with Protein A and Protein G[J].Journal of Immunological Methods,2002,271(1):77-88.

[12] EliasKlein，EvaEichholz，Don H.Yeager.AffinityMembranes Prepared from Hydrophilic Coatings on Microporous Polysulfone Hollow Fibers[J].Journal of Membrane Science,1994,90(1-2):69-80.

[13] C. Staak； F. Salchow,；P.H.et al. Polystyrene as an Affinity Chromatography Matrix for the Purification of Antibodies[J]. Journal of Immunological Methods,1996,194(2):141-146.

[14]Roberts, Michael W H ;Ongkudon, Clarence M ; Forde, Gareth M ;Danquah, Michael K. Versatility of Polymethacrylate Monoliths for Chromatographic Purification of Biomolecules[J]. Journal of Separation Science,2009,32(15-16):2485.

[15]Xi, Fengna ; Wu, Jianmin. Macroporous Chitosan Layer Coated on Non-porous Silica Gel as a Support for Metal Chelate Affinity Chromatographic Adsorbent[J]. Journal of Chromatography A,2004,1057(1-2):41-47.

[16]M, Schuste； E, Wasserbauer； A, Neubauer A, , et al. High Speed Immuno-affinity Chromatography on Supports with Gigapores and Porous Glass[J].Bioseparation,2000,9(5):259-268.

[17]Sjobring, U；Bjorck, L；Kastern, W,J . Streptococcal Protein G Gene Structure and Protein-Binding Properties[J]. Journal of Biological Chemistry,1991,266(1):399-405.

[18]D A Murdoch. Gram-Positive Anaerobic Cocci[J].ClincalMicrobiol Rev,1998,11(1):81-120.

[19]Graille M, Stura E A, Corper A L, et al. Crystal Structure of a Staphylococcus aureusProtein A Domain Complexed with the Fab Fragment of a Human IgM Antibody: Structural Basis for Recognition of B-cell Receptors and Superantigen Activity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2000,97(10):5399-5404.

[20]Derrick JP, Wigley DB. The Third IgG-binding Domain from Streptococcal protein G. An Analysis by X-ray Crystallography of the Structure alone and in a Complex With Fab[J].Journal of Molecular Biology,1994,243(5):906-918.

[21]Graille M, Stura EA, HousdenNG,etal.Complex between PeptostreptococcusmagnusProtein L and a Human Antibody Reveals Structural Convergence in the Interaction Modes of Fab Binding Proteins[J].Structure,2001,9(8):679-687.

[22]Bereli N, Akgo?l S, Yavuz H, et al. Antibody Purification by ConcanavalinA Affinity Chromatography[J].Journal of Applied Polymer Science,2005,97(3):1202-1208.

[23]Babac C, Yavuz H, Galaev IY, et al.Binding of Antibodies to Concanavalin A-modified Monolithic Cryogel[J].Reactive & Functional Polymers,2006,66(11):1263-1271.

[24]P, Konecny； R J, Brown； W H, Scouten. Chromatographic Purification of Immunoglobulin G from Bovine Milk Whey[J]. Journal of Chromatography A, 1994,673(1):45-53.

[25]Kirk Trisler,Loren L. Looger,Vikram Sharma, et al. A Metalloantibody that Irreversibly Binds a Protein Antigen[J]. Journal of Biological Chem istry,2007,282(36):26344-26353.

[26]Hao Qian, ChunJiao Li, ZhiYong Lin, YingXue Zhang. Using Thiophilic Magnetic Beads in Purification of Antibodies from Human Serum[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2010,75(1):342-348.

[27]Irch J R, Racher A J. Antibody Production[J]. Advanced Drug Delivery Reviews,2006,58(5-6):671-685.

[28]PeteGagnon. Improved Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography in the Presence of Polyethylene Glycol[J]. Journal of Immunological Methods,2008,336(2):222.

[29]童紅飛.新型疏水性電荷誘導配基設計及層析分離抗體研究[D].杭州:浙江大學,2014.

[30]Su FT, Sproule K,Husain A, et al. Affinity Chromatography on Immobilized “biomimetic” Ligands. Synthesis, Immobilization and Chromatographic Assessment of an Immunoglobulin G-binding ligand[J]. Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences,2000,740(1):1-15.

[31]Roque ACA, NgelaTM,Lowe CR. Synthesis and Screening of a Rationally Designed Combinatorial Library of Affinity Ligands Mimicking Protein L from Peptostreptococcusmagnus[J]. Journal of Molecular Recognition, 2005,18(3):213-224.

[32]Roque ACA,TaipaM,Lowe CR. An Artificial Protein L for the Purification of Immunoglobulins and Fab Fragments by Affinity Chromatography[J].Journal of Chromatography A, 2005,1064(2):157-167.

[33]Li R, Dowd V, Stewart DJ, et al. Design, Synthesis, and Application of a Protein A Mimetic[J]. Nature Biotechnology,1998,16(2):190-195.

[34]Khoury G E, Wang Y, Wang D, et al. Design, Synthesis, and Assessment of a De NovoAffinity Adsorbent for the Purification of Recombinant Human Erythropoietin[J]. Biotechnology &Bioengineering,2013,110(11):3063-3069.

[35]Haigh J M, Hussain A, Mimmack M L, et al. Affinity Ligands for Immunoglobulins based on the Multicomponent Ugi Reaction[J].Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical & Life Sciences,2009,877(14-15):1440-1452.

[36]Yang H, Gurgel P V, Carbonell R G. Hexamer Peptide Affinity Resins that Bind the Fc Region of Human Immunoglobulin G[J].Chemical Biology & Drug Design,2005,66(s1):120-137.

[37]G. Fassina, A. Verdoliva, M.R. Odierna, et al. Protein A mimetic peptide ligand for affinity purification of antibodies, Journal of Molecular Recognition,1996,9(5-6):564-569.