轉染微小RNA125b抑制序列的三陰性乳腺癌細胞增殖和凋亡變化

聶俊，江波，何文杰，朱穎，涂長玲，董堅

(云南省腫瘤醫院，昆明650118)

三陰性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER-2)均為陰性表達的乳腺癌，約占全部乳腺癌15%～20%[1]。這類乳腺癌由于缺乏特異性靶點，內分泌治療與抗HER-2靶向治療無效，目前治療以手術和放化療為主，但療效不佳，早期局部復發和遠處轉移率較高，總生存率較低，預后差[2]。微小RNA(miRNA)是一種長約22個核苷酸的非編碼小分子RNA，通過結合到靶基因 mRNA 的 3′非翻譯區(3′UTR)，從而降解靶基因 mRNA或抑制其翻譯，實現對靶基因的轉錄后調控，從而參與調控個體發育、細胞代謝、增殖、分化和凋亡等多種生物學過程[3]。微小RNA125b(miRNA-125b)可通過其靶基因調控Wnt[4]、NF-κB[5]、TGF-β[4]、STAT等信號通路，進而影響乳腺癌發生發展。但干擾miRNA-125b表達對TNBC細胞增殖、凋亡及相關通路蛋白表達情況影響的相關研究目前較少。本研究觀察了通過轉染miR-125b抑制物的方法干擾TNBC細胞中miR-125b表達對TNBC細胞MDA-MB-468增殖、凋亡和NF-κB通路蛋白的影響?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及儀器 人MDA-MB-468細胞購自中科院上海細胞庫。補充主要試劑和儀器。10%胎牛血清購自GIBCO公司，DMEM/F12、LTX轉染試劑盒購自Invitrogen公司，Trizol試劑盒、miR-125b引物、U6、miR-125b抑制物、miR-125b陰性對照物購自上海吉瑪制藥技術有限公司。MTT購自Signalway公司、蛋白抗體購自Millipore公司。miR-125b抑制序列為5′ -CTCACAAGTTAGGGTCTCAGGG-3′無關序列的核苷酸序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,均由上海吉瑪公司合成純化。

1.2 MDA-MB-468細胞分組及miR-125b抑制物轉染 MDA-MB-468細胞用L-15培養基(美國GIBCO公司)于37℃、5%CO2培養箱中培養，每天換液1次。待細胞處于對數生長期，并且融合率達90%時傳代。取對數生長期MDA-MB-468細胞調節細胞密度為2×105/μL，接種于24孔板，每孔2 mL。將MDA-MB-468細胞分成miR-125b抑制序列轉染組、無關序列轉染組、空白對照組，每組3孔。miR-125b抑制序列轉染組、無關序列轉染組分別轉染miR-125b抑制序列、無關序列，轉染試劑均為脂質體Lipofectamine，按試劑盒說明書操作。空白對照組不轉染。

1.3 三組細胞中miR-125b的檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測轉染48 h三組細胞miR-125b。按照Trizol試劑盒說明書提取癌組織和細胞總RNA,逆轉錄為cDNA,逆轉錄條件為25℃ 30 mim、42℃ 30 mim、85℃ 10mim，逆轉錄試劑由吉瑪公司提供。cDNA 采用SYBR Seclect Master Mix系統進行實時熒光定量PCR檢測miR-125b的表達，以U6作為內參。miR-125b正向引物5′- ACTGATAAATCCCTGAGACCCTAAC-3′，反向引物5′- TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCAC-3′，U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′ ，反向引物5′- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-△ △CT表示miR-125b相對表達量。

1.4 三組細胞增殖情況觀察 采用MTT法。將轉染完畢的三組細胞胰酶消化后，調整細胞密度為1×105/mL，每孔100 μL含細胞5 000/孔接種于96孔板，繼續培養24、48、72、96、120 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續孵育4 h后棄去培養液，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液，搖床低速震蕩10 min后，用酶標儀在570 mm波長處檢測吸光度(OD570)，以空白培養基調零。實驗重復3次。

1.5 三組細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。轉染72 h后，用無EDTA 的0.25%胰酶將細胞消化成單個，離心收集細胞，棄上清，用預冷PBS洗細胞兩次，再用1×結合緩沖液制成1×106/mL的懸液。Falcon試管中加入100 μL細胞懸液，加入5 μL膜聯蛋白V(Annexin V)-FITC和10 μL 碘化丙啶(PI)染料，輕輕混勻，室溫下避光放置15 min，流式細胞儀測算細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.6 三組細胞NF-κBp65、Caspase-3蛋白檢測 采用Western blotting法。三組細胞長至80%～90%匯合時，分別提取細胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，加入5×Protein Loading Buffer煮沸5 min使蛋白充分變性，-70 ℃保存。以β-actin為內參，每個泳道上樣40 μg蛋白，進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫封閉2 h，分別加入磷酸化的NF-κB p65、Caspase-3一抗(工作濃度1∶200)4℃孵育過夜，洗膜10 min×3次，加二抗(工作濃度1∶1 000)室溫孵育2 h，電化學發光法(ECL)曝光顯影。以NF-κB p65、Caspase-3蛋白條帶與β-actin條帶灰度值之比表示NF-κB p65、Caspase-3蛋白表達量。

2 結果

2.1 三組細胞OD570比較 轉染后不同時點三組細胞OD570見表1。轉染96、120 h 時miR-125b抑制序列轉染組細胞OD570低于無關序列轉染組和空白對照組(P均<0.05)，無關序列轉染組和空白對照組OD570相比P>0.05。轉染24、48、72 h三組細胞OD570相比P均>0.05。

表1 轉染后不同時點三組細胞OD570比較

注：與無關序列轉染組和空白對照組相比，*P<0.05。

2.2 三組細胞凋亡率比較 轉染72 h后miR-125b抑制序列轉染組、無關序列轉染組和空白對照組細胞凋亡率分別為24.85%±2.21%、1.47%±0.78%和1.32%±0.65%。miR-125b抑制序列轉染組細胞凋亡率與無關序列轉染組和空白對照組相比，P均<0.05，無關序列轉染組和空白對照組細胞凋亡率相比，P>0.05。

2.3 三組細胞NF-κBp65、Caspase-3相對表達量比較 三組細胞NF-κBp65、Caspase-3相對表達量見表2。與無關序列轉染組和空白對照組相比，miR-125b抑制序列轉染組細胞NF-κBp65相對表達量下降(P均<0.05)，Caspase-3相對表達量上升(P均<0.05)；無關序列轉染組和空白對照組細胞NF-κBp65、Caspase-3相對表達量相比，P均>0.05。

表2 三組細胞NF-κBp65、Caspase-3相對表達量比較

注：與無關序列轉染組和空白對照組相比，*P<0.05。

3 討論

乳腺癌是高度異質性的腫瘤，早期病理僅從形態學的差異進行區分，之后根據基因表達譜的不同，將乳腺癌分為管腔A型、管腔B型、正常乳腺樣型、HER2過表達型、基底細胞樣型(TNBC屬于此型)5種亞型[6]，各種亞型的生物學行為不同。miRNA是非編碼小分子RNA，通過對靶基因的調控參與乳腺癌的發生發展。不同乳腺癌亞型中miRNA的表達存在差異，這些差異與乳腺癌的分期、激素受體表達水平等因素相關[7]。在正常乳腺組織中，miR-125b、let7c等8個miRNAs在基底樣細胞中的表達高于管腔型細胞， miR-200c、miR-21等6個miRNAs在管腔型細胞中表達高于基底樣細胞，這些在管腔型和基底樣型細胞間差異表達的miRNAs被稱為管腔型細胞特異性miRNA和基底樣細胞特異性miRNA[8]。在乳腺癌中，所有基底樣細胞特異性miRNA在管腔型中表達較低，而miR-125b在具有BRCA-1突變的基底樣乳腺癌和肌上皮樣腫瘤中均高表達[8]。已有研究表明，miR-125b異常表達可通過調節p53、NF-κB等信號通路活性，發揮促進腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤細胞凋亡。但尚未見有關TNBC的類似研究。本研究結果顯示，轉染miR-125b抑制物的TNBC細胞MDA-MB-468內miR-125b的表達下降、增殖活性降低、凋亡率升高，表明表明miR-125b參與TNBC細胞增殖和凋亡的調控。miR-125b可能是診治TNBC的靶點。

NF-κB是一種具有多向調節功能的轉錄因子，通過調控下游基因的表達影響細胞的增殖、炎癥反應、侵襲和凋亡，在惡性腫瘤的發展中具有重要作用。在靜息狀況下，NF-κB連接在IκBs蛋白亞基上，以無活性的形式存于細胞質內。被激活后，NF-κB從抑制亞單位上釋放，導致IκB-α被磷酸化并降解，NF-κB p65亞單位轉位到細胞核內，調節靶基因的表達。NF-κB在TNBC中持續激活，參與TNBC增殖[9]、轉移，并抑制細胞凋亡[10]。NF-κB激活后，可通過上調抗凋亡基因FLIP、凋亡抑制蛋白c-IAP1/2和XIAP以及Bcl-2家族成員的表達[11]，下調Bax、Fas、Bak等促凋亡蛋白的表達，抑制Caspase3 的活性，減少腫瘤細胞的凋亡[12]。因此，抑制NF-κB的活性可能是治療TNBC的方法。

研究表明，在包括乳腺癌在內的許多惡性腫瘤中，NF-κB信號通路活性與miRNA有關，如miR-223通過激活NF-κB促進肺癌的發展[13]，而miR-429通過靶向IKKβ，抑制NF-κB通路的活性，使宮頸癌細胞的生長受抑[14]。多個miR-125b的靶基因參與NF-κB信號通路的調節。miR-125b在膠質母細胞瘤中過表達，可通過抑制其靶基因NF-κB負性調節因子NKIRAS2 和TNFAIP3的表達，增強NF-κB信號通路的活性，促進腫瘤細胞的增殖，抑制細胞凋亡并產生耐藥[5]。miR-125b在鼻咽癌中高表達，通過作用于靶基因A20激活NF-κB通路，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡[15]。此外，miR-125b的一些靶基因是p53的上游調控因子，并且miR-125b可直接下調p53，從而抑制腫瘤細胞凋亡作用。本研究結果顯示，轉染miR-125b抑制物后TNBC細胞MDA-MB-468內NF-κBp65表達量下降，表明在TNBC中miR-125b可參與NF-κB活性的調節。抑制細胞內miR-125b的表達引起的細胞增殖能力下降和凋亡率增加，可能與NF-κB通路活性受抑制有關。調控miR-125b表達可能通過NF-κB通路對TNBC發揮治療作用，這可以作為進一步研究的方向。

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