非小細胞肺癌組織中microRNA-34a的表達變化及其臨床意義

曹建光，曲波，馮磊，于子翔， 陳磊，王豐，付志達

(北京大學首鋼醫院，北京100041)

微小RNA(microRNA)是真核生物體內一類長度約20～25個核苷酸的小分子非編碼單鏈RNA，microRNA與靶基因信使RNA(mRNA)的3′-非翻譯區(3′-UTR)相互作用，抑制mRNA的翻譯或誘導其降解，在轉錄后水平調節靶基因的表達[1, 2]。研究表明，microRNA異常表達能夠導致多種疾病的發生，尤其是腫瘤，microRNA在腫瘤發生、侵襲轉移以及放化療耐藥中均發揮重要的作用[3, 4]。MicroRNA-34家族包括microRNA-34a、microRNA-34b和microRNA-34c三個成員，由2個不同基因編碼，microRNA-34b與microRNA-34c共享一個轉錄本，其編碼基因位于染色質11q23，microRNA-34a具有獨立的轉錄本，其編碼基因位于染色質1p36[5]。大量研究證實，microRNA-34a基因在乳腺癌、結腸癌和肺癌等多種惡性腫瘤細胞和組織中都存在啟動子區的高度甲基化，導致microRNA-34a基因表達沉默[6]。此外，microRNA-34a能夠阻滯細胞周期、誘導細胞壞死和凋亡，具有抑癌基因的功能[7]。然而，關于microRNA-34a在肺癌患者癌組織中的表達及其對肺癌影響的報道尚少。本研究檢測非小細胞肺癌(NSCLC)患者癌組織和癌旁正常組織中microRNA-34a表達，探討其表達與NSCLC臨床病理參數、化療效果和預后的關系，旨在為NSCLC患者的診斷和治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2015年6月收治100例NSCLC患者的癌組織及其癌旁正常組織的手術標本，分別為觀察組和對照組。患者納入標準：具有完整的病例資料，簽署知情同意書，術后病理診斷為NSCLC；排除標準：合并其他惡性腫瘤、全身感染性疾病、肝腎疾病。入組患者男62例、女38例，年齡<60歲患者43例，≥60歲患者57例；吸煙患者73例，不吸煙患者27例；病理分級低分化67例，中高分化33例；組織學分型為鱗癌58例，腺癌34例，其他型肺癌8例；有淋巴轉移83例，無淋巴轉移17例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期68例。本研究已經醫院倫理委員會審核同意，患者均簽署知情同意書。

1.2 兩組標本microRNA-34a檢測 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法。Trizol法提取NSCLC癌組織及癌旁正常組織中總RNA，操作步驟參照RNA提取試劑盒的說明書。紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度(OD260/OD280)，逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，cDNA產物置于-20 ℃保存備用。microRNA-34a正向引物5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3′，反向引物5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；內參U6正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用定量PCR擴增儀檢測microRNA-34a相對表達水平。qRT-PCR反應體系為10 μL，反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10min，然后95 ℃ 15s、60 ℃ 1 min進行40個循環。采用2-ΔΔCt表示microRNA-34a相對表達量。

2 結果

2.1 兩組microRNA-34a表達比較 觀察組、對照組microRNA-34a表達量分別為0.24±0.13、1.05±0.18，兩組相比，P<0.05。

2.2 NSCLC組織中microRNA-34a表達與NSCLC臨床病理參數的關系 NSCLC組織中microRNA-34a表達與NSCLC患者的年齡、性別和吸煙無關(P均>0.05)，與病理分級、組織學分型、淋巴轉移和TNM分期有關(P均<0.05)。詳見表1。

表1 NSCLC癌組織中microRNA-34a表達與患者臨床病理參數的關系

2.3 NSCLC組織中microRNA-34a表達與化療療效的關系 本組共有82患者完成了6個周期的化療。根據RECIST標準[8]，參考CT結果以及腫瘤標志物對化療效果的評價，將患者按照化療效果分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、病變穩定期(SD)和病變進展期(PD)。化療有效(CR+PR)的58例患者和化療無效(SD+PD)的24例患者NSCLC組織microRNA-34a表達量分別為0.36±0.19、0.21±0.14，兩組相比，P<0.05。

2.4 NSCLC組織microRNA-34a表達與患者預后的關系 以中位數為界限，將NSCLC患者分為microRNA-34a低表達者50例與microRNA-34a高表達者50例，繪制Kaplan-Meier生存曲線。microRNA-34a高表達組NSCLC患者的5年總生存率為92.00%(46/50)，顯著高于microRNA-34a低表達組者的70.00%(35/50)，P<0.05。microRNA-34a高、低表達者的生存時間分別為(56.94±1.56)、(52.54±2.24)個月，P<0.05。

3 討論

世界范圍內，肺癌是導致人類死亡的主要惡性腫瘤之一。研究發現，我國肺癌的發病率和病死率居高不下，約占所有惡性腫瘤的20%～25%[9]。NSCLC是最常見的肺癌類型，約占肺癌發病人群的80%左右[10]。侵襲轉移和放化療耐藥是導致NSCLC患者不良預后的主要因素[11]，因此深入探究NSCLC發生侵襲轉移和放化療耐藥的內在機制，尋找能夠逆轉侵襲轉移和放化療耐藥的生物靶標，是臨床亟需解決的問題之一。近年來，關于microRNA在腫瘤發生和惡性進展中的功能研究，已成為研究熱點，如有研究證實，microRNA-29b在結腸癌的癌組織和血清中均低表達，血清microRNA-29b表達水平可以作為結腸癌的潛在診斷指標[12]。MicroRNA-34a在多種惡性腫瘤中發揮抑癌基因的功能，如在頭頸部鱗狀細胞癌中，microRNA-34a參與抑制細胞周期和細胞老化過程[13]；在乳腺癌中microRNA-34a與HER2表達水平之間呈負相關性，microRNA-34a表達丟失有望成為乳腺癌的潛在診斷指標之一[14]。本研究結果顯示，NSCLC組織中microRNA-34a表達水平明顯低于癌旁正常組織，初步證實microRNA-34a在NSCLC發生過程中具有抑癌基因功能，與Zhou等[15]在胃癌中對microRNA-34a的研究結果一致。

此外，本研究對microRNA-34a表達與NSCLC患者臨床病理特征之間關系的研究發現， microRNA-34a低表達與NSCLC患者癌組織的病理分級、組織學分型、淋巴結轉移和TNM分期密切相關，提示在NSCLC組織中microRNA-34a低表達預示著患者的癌組織分化程度較低，可能存在淋巴轉移以及可能處于疾病晚期，但是關于microRNA-34a在NSCLC腫瘤發生及惡性進展中的發揮的具體作用機制，本研究并未進行深入探討。大量研究證實，microRNA-34a具有抑制腫瘤細胞增殖、侵襲遷移等功能，如在絨毛膜癌細胞中，microRNA-34a抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲[16]；在骨肉瘤細胞中microRNA-34a通過抑制CD44基因表達，導致細胞侵襲轉移能力下降[17]；此外，microRNA-34a通過下調ALDH2基因表達，促進心肌梗死后的心肌細胞發生凋亡[18]。本研究后期將對microRNA-34a在NSCLC腫瘤發生及惡性進展中的具體作用機制做進一步地研究。本研究結果顯示，化療有效組(CR+PR)患者的癌組織中microRNA-34a表達水平顯著高于化療無效組(SD+PD)，表明microRNA-34a在NSCLC獲得性化療耐藥中發揮作用，但并未對內在具體機制進行深入研究。Zhou等[19]的研究發現，在NSCLC細胞中過量表達microRNA-34a后，細胞增殖被抑制，誘導細胞發生凋亡，且能夠部分逆轉細胞對吉非替尼的化療耐藥；Duan 等[20]在NSCLC細胞中的研究發現，恢復microRNA-34a表達后，能夠抑制LyGDI信號通路活性，從而增強細胞的放療敏感性，microRNA-34a有望成為NSCLC患者的放療增敏劑，提高NSCLC患者的放療療效。此外，Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，microRNA-34a低表達組NSCLC患者的5年總生存率、平均生存時間均明顯低于microRNA-34a高表達組，表明microRNA-34a低表達NSCLC患者的預后并不樂觀，microRNA-34a具有作為NSCLC患者不良預后指標的潛力。

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