乳腺癌組織中EZH2、SOX4蛋白表達變化及其意義

韓福蘭,毛榮軍,謝樂,吳燕杏,曾敏,陳增偉

(廣東省佛山市中醫院,廣東佛山528000)

乳腺癌致死的主要原因是癌細胞脫落后隨淋巴或血液播散全身，形成轉移病灶、種植腫瘤或乳腺癌復發。因此測定乳腺癌轉移的生物指標，明確其轉移機制，是制定合理乳腺癌臨床抗腫瘤治療方案、改善乳腺癌患者預后的一個研究熱點[1，2]。果蠅zeste 基因增強子的人類同源物2(EZH2)基因編碼的EZH2蛋白是轉錄抑制子多梳蛋白復合體2(PRC2)的組成部分[3]，其主要通過催化組蛋白甲基化作用，調控胚胎干細胞的分化，促進前列腺癌、膀胱癌、肝癌等腫瘤細胞上皮-間質轉化(EMT)，進而促進腫瘤細胞的轉移[4]。另有研究顯示，轉錄因子Y染色體性別決定區相關高遷移率盒蛋白4(SOX4)通過激活TGF-β途徑促進卵巢癌細胞EMT，進而提高卵巢癌細胞侵襲力[5，6]。但乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達變化及其臨床意義尚不明確。本研究探討了乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達變化，并分析其與乳腺癌患者臨床病理參數、預后的關系，探討乳腺癌中EZH2、SOX4作為腫瘤標記物的可能性。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年10月～2015年6月于我院行手術治療的乳腺癌患者97例。納入標準：經病理學確診為乳腺癌，原發且術前未行抗腫瘤治療。排除標準：年齡≥75周歲，合并其他腫瘤，術前經放、化療，合并其他嚴重疾病。納入患者均為女性，年齡21～68(52.1±8.3)歲。腫瘤直徑≤3 cm者31例，>3 cm者66例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期84例，Ⅲ～Ⅳ期13例；分化程度高分化28例，中低分化69例；有淋巴結轉移49例，無淋巴結轉移48例。留取手術切除乳腺癌組織標本為觀察組，癌旁正常組織標本為對照組(均切取自距離腫瘤組織≥3 cm處，病理檢查證實為正常乳腺組織)。

1.2 EZH2、SOX4蛋白檢測 采用免疫組化SP法。 將保存的石蠟包埋標本4 μm層厚連續切片，常規脫蠟復水，按免疫組化SP法試劑盒(購自北京百奧萊博科技有限公司)說明操作。兔抗人SOX4多克隆抗體、兔抗磷酸化抑癌蛋白EZH2多克隆抗體均購自北京百奧萊博科技有限公司。以PBS為陰性對照，已知陽性染色切片為陽性對照。封片后鏡下觀察。

取4個100倍光學鏡下視野，每個視野至少含有200個細胞。①染色強度：無色計0分，淡黃色計1分，黃棕色計2分，棕褐色計3分。②陽性染色細胞數量占比：<5%計0分，5～<25%計1分，25～<50%計2分，50～<75%計3分，≥75%計4分。將兩項得分相乘，結果0～3分為陰性表達，≥3分為陽性表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman 秩相關檢驗。將患者術后出院視為觀察起點，隨訪截止于2016年11月，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-Rank法比較累積生存率和總生存時間。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組EZH2、SOX4蛋白表達比較 觀察組、對照組EZH2蛋白表達陽性率分別為80.41%(78/97)、48.45%(47/97)，兩組相比，P<0.05;SOX4蛋白陽性表達率分別為82.47%(80/97)、57.73%(56/97)，兩組相比，P<0.05。

2.2 觀察組乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達與乳腺癌患者臨床病理參數的關系 乳腺癌組織中EZH2蛋白表達與患者的年齡、腫瘤大小、TNM分期均無關(P均>0.05)，與淋巴結轉移和分化程度相關(P均<0.05)；乳腺癌組織中SOX4蛋白表達與患者的年齡、腫瘤大小、TNM分期、分化程度均無關(P均>0.05)，與淋巴結轉移相關(P<0.05)。

表1 乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達與乳腺癌臨床病理參數的關系

2.3 乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達的相關性 Spearman 秩相關檢驗結果顯示乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達呈顯著正相關(γs=0.251，P=0.013)。

2.4 乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達與患者預后的關系 觀察組患者隨訪13～71個月，中位隨訪時間44個月。EZH2蛋白表達陰性、陽性者累積生存率分別為89.47%(17/19)、65.38%(51/78)，生存時間分別為(67.14±2.62)、(54.30±2.30)個月，EZH2蛋白表達陰性、陽性者累積生存率和總生存時間相比，P均<0.05。SOX4蛋白表達陰性、陽性者累積生存率分別為94.41%(16/17)、65.00%(52/80)，生存時間分別為(68.75±2.15)、(54.35±2.27)個月，SOX4蛋白表達陰性、陽性者累積生存率和總生存時間相比，P均<0.05。

3 討論

EZH2是哺乳動物體內組蛋白H3K27甲基化必須的兩種催化酶之一[7]。EZH2為中心的復合物PRC2介導H3K27形成H3K27me3，沉默包括Wnt在內的多個通路相關基因的表達，從而促進細胞EMT，抑制細胞衰老[8]和細胞分化[9]。因此可以推測EZH2蛋白表達的增強往往意味著腫瘤惡性程度的提高。目前已有研究表明EZH2在多種腫瘤組織中高表達，包括前列腺癌[10]、神經膠質瘤[11]、胃癌[12]等。本研究結果表明，乳腺癌組織中EZH2陽性表達率顯著高于癌旁非腫瘤組織，與推測和前人研究結果相符。同時EZH2在組織分化程度較低、發生淋巴結轉移的乳腺癌患者中的陽性表達率顯著高于對照組，也與EZH2抑制細胞分化、促進腫瘤細胞EMT的作用相符。

基因家族SOX調控胚胎的發育，決定細胞的命運。任何SOX基因的缺失、過表達或者突變都有可能造成心臟瓣膜缺失、腭裂等先天發育異常類疾病[13]。SOX4隸屬于SOX家族C族，目前僅找到一種由其編碼的蛋白產物，即SOX4蛋白，胚胎發育相關的上皮細胞與間質細胞中均已發現SOX4蛋白表達，且SOX4能夠促進相關胚胎細胞的增殖[14]。研究表明，SOX4蛋白能夠調控TGF-β通路[15]、PTEN/PI3K/AKT信號通路[16]、Wnt信號轉導通路[17]等腫瘤相關信號通路，從而促進腫瘤細胞EMT，進而一定程度上誘導腫瘤的發生，增加腫瘤的細胞的侵襲力。因此SOX4基因的異常高表達與多種惡性腫瘤疾病的發生發展密切相關，目前已經得到證實的有肺癌[18]、白血病[19]、前列腺癌[20]等。本研究發現，SOX4在乳腺癌組織中陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，與前人研究結果相類似，這表明SOX4在乳腺癌細胞中的作用與其在其他腫瘤細胞中的相同。而SOX4對于EMT的促進作用則體現在SOX4在發生了淋巴結轉移的患者組中陽性表達率顯著提高。同樣的，SOX4蛋白表達陽性的乳腺癌患者組累積生存率與總生存時間均顯著低于陰性組，也提示SOX4蛋白表達陽性意味著患者預后較差。而與推測不同的是，本研究未發現SOX4蛋白表達在組織分化程度不同的患者組中有差異，這可能是因為SOX4調控的信號通路眾多，相互作用復雜，對腫瘤細胞分化的促進與抑制作用并存，從而無法檢測出明顯的差異。

Pan等[21]研究發現，SOX4能夠通過調控EZH2蛋白表達從而調節細胞EMT。本研究Spearman 秩相關檢驗結果顯示EZH2與SOX4蛋白表達呈現顯著正相關，提示在乳腺癌組織中SOX4對EMT的調控可能同樣通過對EZH2蛋白表達的調控而實現，兩者有一定程度上的協同作用。本研究結果還顯示，EZH2、SOX4蛋白表達陽性的乳腺癌患者預后較差，提示檢測乳腺癌組織EZH2、SOX4蛋白表達有助于臨床醫師判斷患者預后，有一定臨床意義。

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