維持母胎免疫耐受中髓源抑制性細胞的作用研究

柳小梅，葉雙來，季風

（青田縣人民醫(yī)院，浙江 青田323900）

妊娠中的胎兒對于母體就是一種“同種異基因移植物”，如何對這種“同種異基因”耐受，是保證胎兒健康發(fā)育的關(guān)鍵[1]。妊娠中的母體需要調(diào)節(jié)自身的免疫以適應這種狀態(tài)，如果發(fā)生異常就會流產(chǎn)，臨床有一類無明確病因的流產(chǎn)，被定義為原因不明復發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA），目前認為免疫調(diào)節(jié)功能的紊亂是URSA的主要原因[2]。髓源抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）包括髓系前體細胞、不成熟的粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等髓系來源的一群異質(zhì)細胞，研究表明MDSCs可通過多種途徑抑制機體的免疫系統(tǒng)[3]，例如移植物抗宿主反應，腫瘤患者體內(nèi)的免疫抑制狀態(tài)等[4]。本研究探索了髓源抑制性細胞在維持母胎免疫耐受中的作用，以期為原因不明復發(fā)性流產(chǎn)尋找新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2015年12月～2016年12月正常妊娠孕婦及原因不明復發(fā)性流產(chǎn)孕婦各50例，分別為正常妊娠和URSA組，另選擇同期體檢健康的非妊娠女性50例作為對照組。正常孕婦年齡 25～39 歲，平均（29.3±5.3）歲；URSA 孕婦年齡26～42 歲， 平均 （29.7±5.3） 歲，URSA 孕婦在孕（19.73±4.54）周時發(fā)生流產(chǎn)。對照組非妊娠女性年齡 24～40 歲，平均（29.5±5.2）歲。 三組年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑 淋巴細胞分離液購自美國MP Biomedicals 公 司 ，F(xiàn)ITC-Lin、PE-HIA-DR、APCCD33、FITC-CD4、APC-CD25熒光標記抗體以及相應的同型對照購于美國RD公司，流式細胞儀為美國BD公司FACSCalibur型，分析軟件為流式細胞儀自帶CellQuest Pro軟件。

1.3 檢測方法 流式細胞儀檢測髓源抑制性細胞（MDSCs）和調(diào)節(jié)性T淋巴細胞（Treg）正常妊娠組取12周、24周、36周孕檢時10mL抗凝靜脈血，URSA組取12周孕檢時10mL抗凝靜脈血，對照組取體檢時10mL抗凝靜脈血，每份樣本加入10mL淋巴細胞分離液，混勻1000g離心10分鐘，吸取中間粒細胞層，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，置于0～4℃待測。每例樣本取細胞懸液200μL，加入FITCCD4、APC-CD25抗體4μL避光染色30分鐘檢測Treg細胞，另取細胞懸液 200μL，加入 FITC-Lin、PE-HIA-DR、APC-CD33抗體4μL避光染色30分鐘檢測MDSCs細胞，流式細胞儀檢測染色細胞，CellQuest Pro軟件分析 CD4+CD25+Treg和Lin-HIA-DR-CD33+MDSCs細胞的比例。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行分析，t檢驗分析計量資料，多組間比較采用方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 外周血MDSCs和Treg的比例變化 從表1和圖1可見，對照組、URSA組（孕12周）以及正常妊娠組（孕12周）外周血MDSCs的比例三組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），正常妊娠組MDSCs和Treg顯著高于 URSA 組（P＜0.05），URSA 組 MDSCs和 Treg又顯著高于對照組（P＜0.01）。

表1 三組外周血MDSCs和Treg比例的變化（%）

圖1 對照組、正常妊娠組和URSA組外周血MDSCs和Treg的流式細胞圖

2.2 MDSCs和Treg的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示妊娠孕婦外周血MDSCs和Treg比例呈顯著正相關(guān)（r=0.413，P＜0.05）。

3 討論

胎兒有一半的基因源于父親，這些基因編碼的主要組織相容性抗原對于母親是一種同種異基因抗原，母胎的免疫耐受是妊娠建立和維持的關(guān)鍵[5]。MDSCs在降低移植排斥反應方面發(fā)揮著重要的作用[6]。Treg是機體內(nèi)發(fā)揮免疫抑制作用的主要CD4陽性的T淋巴細胞，在多種免疫異常性疾病中可以發(fā)現(xiàn)Treg比例的減低，Zhu等[7]研究發(fā)現(xiàn)Treg細胞平衡的失常是原因不明自然流產(chǎn)的主要原因。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)Treg細胞分化成熟受到MDSCs的調(diào)節(jié)，MDSCs升高可以誘導CD4陽性T淋巴細胞向Treg細胞分化成熟。Pan等[9]在妊娠大鼠的實驗中證實MDSCs可以通過STAT3信號通路維持母胎免疫耐受。上述研究結(jié)果提示了MDSCs通過Treg細胞調(diào)節(jié)了妊娠的母胎免疫耐受維持。

本研究觀察到孕婦外周血MDSCs比例顯著升高，在URSA孕婦中MDSCs比例顯著低于正常妊娠孕婦，提示了孕婦外周血MDSCs升高對于維持母胎免疫耐受發(fā)揮著一定的作用，其不能正常升高可能是導致孕婦URSA的原因。本研究也觀察到了URSA孕婦外周血Treg細胞比例顯著低于正常妊娠孕婦，說明Treg細胞也參與了妊娠母體免疫耐受的維持。相關(guān)性分析顯示，MDSCs與Treg細胞呈顯著正相關(guān)，提示了孕婦體內(nèi)兩者間的相互調(diào)節(jié)密切關(guān)系。上述結(jié)果說明MDSCs的不足可能難以維持母胎的免疫耐受，導致流產(chǎn)發(fā)生。

總之，本研究顯示妊娠期MDSCs高表達刺激了Treg細胞分化成熟，從而維持了母胎免疫耐受，MDSCs減低是URSA的一個可能原因。

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