血管內亞低溫治療對腦缺血性癲癇大鼠神經元異常放電的作用及機制

周艷輝，劉春苗，楊國帥，余丹，周律，劉炫軍(海口市人民醫院，海口570208)

癲癇是一種以神經元異常放電為主要病理特征的致殘性神經系統病變，是發作性意識喪失的常見原因。其病理機制涉及神經遞質代謝異常、神經元凋亡、離子通道功能失衡及突觸重塑等多重細胞與分子生物學行為的異常[1，2]。目前，臨床治療癲癇的主要目標是控制急性發作癥狀，尚無理想方案改變其神經病理，也不能阻止其自然病程，從細胞與分子水平有效抑制其病理進程仍然是未來研究的方向。亞低溫治療腦缺血、腦損傷取得了良好的成效，其腦保護作用機制包括降低腦氧耗與顱內壓、提高腦灌注及抑制興奮性神經遞質的過度釋放等。有研究指出，亞低溫治療對改善癲癇有積極作用[3～5]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在神經元發育及突觸重塑中發揮重要作用，是近年研究癲癇病理機制的熱點。2016年6～12月，本研究探討血管內亞低溫治療對腦缺血性癲癇大鼠神經元異常放電的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 SPF級雄性SD大鼠100只，6～8周齡，體質量(200±20)g，購自浙江大學實驗動物中心。雷帕霉素(輝瑞制藥有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；mTOR多克隆兔抗、mTOR phospho S2448多克隆兔抗、S6K1單克隆兔抗、S6K1 phospho T389多克隆兔抗、AKT1多克隆兔抗、AKT1 phospho S473多克隆兔抗(abcam)。S240解剖學顯微鏡、CH20-BIM光學顯微鏡(OLYMPUS)；BL310生物機能試驗系統(成都泰盟補充公司全稱)；腦立體定位儀(美國Stoleting公司)；MDF-382EN深低溫冰箱(日本三洋公司)。

1.2 動物分組與模型制備 大鼠適應性飼養1周，采用隨機數字表法分為空白組、假手術組、模型組、亞低溫組、mTOR抑制劑組共5組，每組20只。空白組正常飼養，模型組、亞低溫組、mTOR抑制劑組均采用血管內線栓閉塞法制備腦缺血癲癇模型。模型制備方法：大鼠用戊巴比妥腹腔注射麻醉(45 mg/kg)，立體定位儀固定，監測腦電圖。取頸部正中切口，依次分離皮膚和皮下組織，顯露頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈及其分支。夾閉頸內動脈能夠有效阻斷全腦供血，采用線栓法在右側CCA近分叉處暫時夾閉血管，手術鉗內推至頸內動脈，并勒緊。多普勒流量計監測皮質腦血流量，皮質腦血流量下降70%以上，且監測到癲癇波(NCS)為造模成功。模型制備成功后，亞低溫組予以亞低溫治療3 h/d；mTOR抑制劑組腹腔注射mTOR抑制劑雷帕霉素0.27 mg/kg，1次/d。均持續治療3 d。除去死亡大鼠，空白組、假手術組、模型組、亞低溫組、mTOR抑制劑組最終剩余大鼠分別為20、18、15、14、16只。

1.3 大鼠神經元異常放電頻率檢測 用戊巴比妥麻醉大鼠，立體定位儀固定，使用美國epoch小動物腦電/心電遙測記錄系統測定腦電圖。于頭雙側額頂部對稱性鉆4個孔至皮層，分別植入4個記錄電極，在跨橫竇竇匯及人字縫處鉆1個孔植入參考電極。獲取腦電波并傳輸至多參數顯示儀，自動記錄NCS出現的頻率與時間，連續監測12 h，神經元異常放電頻率=NCS波持續時間/總時間×100%。

1.4 大鼠神經功能評價 采用Longa的5分制法[6]評價大鼠神經行為學。將神經損傷分為0、1、2、3、4分共5個評分等級，0分：大鼠活動正常；1分：前爪屈伸困難；2分：行走向對側轉圈；3分：行走向對側傾倒；4分：完全無法行走。

1.5 大鼠腦梗死率測算 造模后3 d，5組各取6只大鼠，直接斷頭取腦，置于-20 ℃冷凍定型。腦組織冠狀切片，厚度約2 mm，置于1% TTC染液中，37 ℃孵育20 min，被染成灰白色區域為梗死區域。采用圖像分析軟件Image Pro Plus分析各切片梗死區域占比，并計算腦梗死率。

1.6 大鼠海馬組織中mTOR通路相關蛋白表達檢測 采用Western blotting法。造模后3 d取5組剩余大鼠進行麻醉，斷頭取腦，分離海馬組織。冰上剝離海馬組織，生理鹽水沖洗干凈血液，置入無菌EP管，-70 ℃勻漿。冰上解凍，電動勻漿機勻漿，用TRIzol法提取海馬總蛋白，溶解于buffer緩沖液，并采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，最終稀釋為1 μg/μL。配置SDS-PAGE凝膠，每個通道上樣10 μL，以40 V電壓預電泳30 min清除凝膠內雜質，90 V電壓電泳60～90 min。將電泳后的凝膠條帶轉印至NC膜，5%脫脂牛奶封閉90 min，37 ℃振蕩搖勻。封閉后可即刻進行抗體孵育，以3%的脫脂牛奶溶解抗體，一抗孵育4 ℃過夜；二抗孵育37 ℃ 90 min。ECL顯色液顯色，暗室顯影，保留膠片，用Image J分析灰度值作為目標蛋白相對表達量。計算磷酸化蛋白激酶B(p-AKT1)/AKT1、磷酸化mTOR(p-mTOR)/mTOR、磷酸化核糖體蛋白S6激酶1(p-S6K1)/S6K1。

2 結果

2.1 各組神經元異常放電頻率及神經行為學評分比較 空白組、假手術組、模型組、亞低溫組、mTOR抑制劑組神經元異常放電頻率分別為10.7%±3.4%、11.5%±3.7%、63.2%±6.4%、33.2%±6.7%、35.2%±5.8%。空白組與假手術組神經元異常放電頻率比較差異無統計學意義(P均<0.05)；與空白組、假手術組比較，模型組神經元異常放電頻率高(P均<0.05)；與模型組比較，亞低溫組、mTOR抑制劑組神經元異常放電頻率低(P均<0.05)；亞低溫組與mTOR抑制劑組神經元異常放電頻率比較差異無統計學意義(P均<0.05)。

2.2 各組神經行為學評分分布比較 模型組神經行為學評分分布與空白組、假手術組比較差異有統計學意義(P均<0.05)，與亞低溫組、mTOR抑制劑組比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組神經行為學評分分布比較(只)

2.3 各組腦梗死率比較 空白組、假手術組、模型組、亞低溫組、mTOR抑制劑組腦梗死率分別為11.2%±2.4%、12.3%±2.7%、88.5%±11.4%、50.2%±6.5%、66.1%±7.4%。空白組與假手術組腦梗死率比較差異無統計學意義(P均<0.05)；與空白組、假手術組比較，模型組腦梗死率高(P均<0.05)；與模型組比較，亞低溫組、mTOR抑制劑組腦梗死率低(P均<0.05)；與亞低溫組比較，mTOR抑制劑組腦梗死率高(P<0.05)。

2.4 各組mTOR通路相關蛋白表達比較 與空白組、假手術組比較，模型組p-AKT1/AKT1、p-mTOR/mTOR及p-S6K1/S6K1高(P均<0.05)；與亞低溫組、mTOR抑制劑組比較，模型組p-AKT1/AKT1、p-mTOR/mTOR及p-S6K1/S6K1低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組mTOR通路相關蛋白表達比較

2.5 異常放電頻率與其他指標的相關性 經Pearson相關分析結果顯示，模型組、亞低溫組、mTOR抑制劑組異常放電頻率與p-AKT1/AKT1、p-mTOR/mTOR及p-S6K1/S6K1呈正相關(r分別為0.689、0.884、0.861，P均<0.01)。

3 討論

腦缺血與癲癇雖然是兩種獨立的疾病，卻存在因果關系。腦缺血是癲癇的常見病因，腦梗死患者的癲癇發病風險是非腦血管病患者的23倍。兩者有可能存在同樣的病理機制，這也是腦缺血制備癲癇模型的理論依據[7，8]。腦缺血患者的神經細胞同時面臨缺血再灌注損傷、炎癥反應、細胞凋亡等一系列病理損傷，線粒體功能障礙妨礙了突觸傳遞而致使癲癇發生率升高。反之，癲癇的發生又能夠加重神經細胞的損傷。近十幾年，隨著抗癲癇藥物的開發，癲癇患者的生存質量得到了較大提高，但抗癲癇藥的治療目標尚局限于緩解臨床癥狀。另外尚有20%～40%的難治性癲癇患者對抗癲癇藥物不敏感，還需繼續探索新的抗癲癇方案。亞低溫治療最初應用于顱腦損傷和腦梗死的臨床治療[9，10]，后經證實也適用于改善癲癇導致的腦損傷[11，12]，但其病理機制尚未明確。本研究以腦缺血的方式制備癲癇模型，觀察血管內亞低溫治療對腦缺血性癲癇大鼠模型海馬區神經元異常放電的影響，為完善其作用機制提供數據支撐。

本研究整體造模成功率為75.0%，這一數據與其他研究[13]的數據基本一致。24 h腦電圖是診斷和評估癲癇發病程度的重要手段之一，利用癲癇的特有放電信號判斷病變狀態，是臨床診斷與評價癲癇的主要依據。因此本研究以腦電圖異常放電頻率作為首要考察指標。研究結果顯示與空白組和假手術組相比，模型組的異常放電頻率和梗死率高，同時神經行為學評分分布降低；與模型組相比，亞低溫組和mTOR抑制劑組的異常放電頻率和梗死率低，同時神經行為學評分高。該結果較為直觀地說明亞低溫治療與mTOR抑制劑均能夠較好的抑制腦缺血性癲癇大鼠的神經元異常放電。

癲癇的發病機制極為復雜，作為調節細胞生長和細胞周期進程的信號匯聚點，mTOR信號通路起了關鍵性作用。神經元異常凋亡、突觸重構和能量代謝異常均是癲癇的重要病理特征，而這些生物學行為均離不開mTOR信號通路的參與[14，15]。在紅藻氨酸誘發的癲癇中觀測到mTOR信號通路的異常激活，且證實雷帕霉素干預可有效抑制神經元異常放電[16]。而本研究結果發現，在腦缺血誘發的大鼠癲癇模型中，雷帕霉素同樣有效抑制神經元異常放電。進一步數據分析結果顯示，神經元異常放電頻率與海馬區P-AKT1/AKT1、P-mTOR/mTOR及P-S6K1/S6K1呈正相關，說明mTOR信號通路參與了腦缺血性癲癇的發生發展。另有研究證實，mTOR信號通路廣泛參與了皮質發育畸形所致癲癇、病毒感染所致癲癇、大腦腫瘤所致癲癇等多種獲得性癲癇模型的病理進程，很有可能既是癲癇發作的結果，也是促進癲癇進展的因素[17]。

mTOR屬于PI3K相關蛋白激酶家族，有mTORC1和mTORC2兩種形式，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，能使底物的Ser/Thr發生磷酸化[18]。其中PI3K與AKT是mTOR的上游信號，刺激源首先活化PI3K，活化的PI3K促進AKT磷酸化，進而上調mTORC1表達。S6K1是mTORC1的重要下游信號，磷酸化后可啟動核糖體與蛋白質的生物合成[19]，而該過程與突觸形成息息相關。本研究結果顯示，在改善腦梗死和抑制神經元異常放電方面，亞低溫治療與mTOR抑制劑能取得相仿的效果。為明確亞低溫治療是否對mTOR信號通路有影響，本研究對各組大鼠海馬區p-AKT1/AKT1、p-mTOR/mTOR及p-S6K1/S6K1做了測算，結果顯示與空白組和假手術組相比，模型組以上比值高；與模型組相比，亞低溫組和mTOR抑制劑組以上比值低。可見亞低溫治療對p-AKT1/AKT1、p-mTOR/mTOR及p-S6K1/S6K1的作用與mTOR抑制劑一致，亞低溫治療也能抑制mTOR通路，從而緩解神經元異常放電。

綜上所述，亞低溫治療能夠抑制腦缺血性癲癇大鼠海馬區mTOR通路，從而緩解神經元異常放電。這可能為其治療癲癇的重要機制之一。

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