無血清EGM-2 BulletKit對骨髓間充質干細胞向血管內皮細胞分化的誘導作用

王承恩，楊敏，李淵，劉繪繪，梁賾隱，尹玥，佟小強，宋莉，牛國晨，閆子光，張碧輝，鄒英華(北京大學第一醫院，北京100034)

隨著生活水平的提高，下肢動脈硬化閉塞癥患病人數正逐年上升，輕者出現間歇性跛行、靜息痛，重者出現潰瘍、壞疽，甚者危及生命[1]。隨著介入治療技術的發展，血管腔內治療已成為一種主要治療方法。然而，對于多節段、彌漫性、缺乏遠端動脈流出道的病變，即便介入治療也存在一定局限性，難以取得滿意療效。隨著“治療性血管新生”理念的提出，通過植入內皮細胞促進血管新生有望為下肢動脈硬化閉塞癥的治療帶來希望。但人體內可用的內皮細胞少，難以滿足臨床需求[2]。人體骨髓中含有大量間充質干細胞(MSC)。有研究[3]通過含胎牛血清的誘導培養基可將MSC誘導分化為內皮細胞。但血清成分復雜，有潛在致病源，用于人體有極大安全隱患，而且既往誘導方案效率低、不穩定。2016年7月～2017年3月，本研究擬通過無血清內皮細胞生長培養基套裝(EGM-2 BulletKit)高效、穩定地將MSC誘導分化為血管內皮細胞，使其具有內皮細胞的特性、功能，為臨床應用內皮細胞治療下肢缺血性疾病提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 EGM-2 BulletKit購自瑞士Lonza公司，人淋巴細胞分離液(Ficoll)購自天津灝洋公司，熒光標記的流式抗體(APC-CD29、PE-Cy7-CD44、FITC-CD90、PE-CD105、PerCP-Cy5.5-CD31)購自美國Biolegend公司，CD31一抗、CD34一抗、Fluor-488標記的IgG抗體、DAPI封閉液購自上海碧云天公司，胰酶購自美國Invitrogen公司；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，離心機、恒溫培養箱購自美國Thermo Fisher公司，流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 MSC分離、培養及鑒定 骨髓來自本院血液科1例男性骨髓移植健康供者，年齡35歲，術前血液學檢查無異常。使用普通肝素鈉抗凝，用磷酸鹽緩沖液(PBS)與骨髓等比例混合后小心加入淋巴細胞分離液(Ficoll)上，800 g離心20 min，吸走中間層全部單個核細胞，加入適量PBS混勻，700 g離心5 min，吸棄上清、洗滌，500 g離心5 min，加入無血清的EGM-2基礎培養基重懸，調整細胞濃度，按2×105/cm2接種到6孔培養板上，于37 ℃、5% CO2孵箱培養。48 h后換液，棄未貼壁細胞，以后2 d換液1次。于倒置相差顯微鏡下觀察MSC生長情況。待貼壁細胞出現典型的長梭形結構時，胰酶消化、離心、PBS洗滌2次，制成細胞懸液100 μL，加入APC-CD29、PE-Cy7-CD44、FITC-CD90、PE-CD105、PerCP-Cy5.5-CD31流式抗體各1 μL，充分混勻后室溫避光孵育20 min，PBS洗滌，500 g離心5 min，加PBS 200 μL重懸，通過流式細胞儀檢測以上表面分子表達情況，計算陽性細胞比例。CD29、CD44、CD90、CD105表達90%以上且CD31無表達為無內皮細胞污染的高純度MSC。

1.3 MSC的誘導分化及結果鑒定 將獲得的MSC隨機分為對照組與誘導組。對照組應用無血清EGM-2基礎培養基進行培養；誘導組選用無血清+BulletKit進行誘導，誘導培養基包括血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)，2 d換誘導培養基1次。于倒置相差顯微鏡下定期觀察細胞變化。于誘導第2、6、10、14天用流式細胞儀檢測CD31表達陽性的內皮細胞比例。進一步采用細胞免疫熒光法對分化結果進行鑒定，顯示綠色熒光則為CD31表達陽性。PBS清洗細胞3次，每次10 min，4%多聚甲醛固定至少20 min，PBS洗滌3次，加入3%牛血清白蛋白500 μL封閉非特異性抗原，30 min后去掉封閉液，加兔抗人CD31抗體，4 ℃避光孵育24 h，去掉一抗，PBS清洗3次，加入Fluor-488標記的羊抗兔抗體，室溫避光孵育2 h，去掉二抗，PBS清洗3次，滴加二脒基苯基吲哚10 μL封閉液染色10 min，通過熒光顯微鏡觀察誘導后的細胞是否呈現綠色熒光并拍照。

1.4 MSC誘導分化后吞噬功能檢測 采用DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)吞噬實驗。誘導第14天取兩組細胞，棄原培養液，加入含有10 μg/mL DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白的無血清EGM-2基礎培養基，37 ℃恒溫孵箱孵育4 h，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛至少固定20 min，通過熒光顯微鏡觀察誘導后的細胞是否呈現紅色熒光并拍照。

1.5 MSC誘導分化后成管功能檢測 采用基底膜基質膠(Matrigel)成管實驗。實驗前1天將Matrigel放入4 ℃冰箱過夜凍融，按1∶1比例與無血清培養液稀釋。誘導14 d，取對照組與誘導組細胞，在96孔板孔內滴加稀釋的Matrigel 50 μL，于37 ℃恒溫孵箱放置30 min，使其凝固成膠狀。兩組各設3個復孔，每孔加入2×104個細胞，于孵箱培養12 h，通過顯微鏡觀察誘導后的細胞是否能夠形成管狀結構并拍照。

2 結果

2.1 MSC分離及鑒定結果 MSC接種2 d后首次換液，在顯微鏡下可見少量貼壁的梭形細胞，形態類似成纖維細胞，隨培養時間延長，貼壁的梭形細胞增殖加快，細胞密集生長，呈魚群狀、漩渦狀排列。流式細胞儀測定MSC表面標志物顯示CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽性，陽性細胞比例均>95%，而內皮細胞特異標志物CD31無表達。

2.2 MSC向血管內皮細胞分化的結果 倒置相差顯微鏡下觀察，誘導組細胞形態由長梭形逐漸縮短，部分呈現短梭形或多角形。誘導組誘導第2天CD31開始表達，隨誘導時間增加，CD31表達量逐漸升高，誘導第14天CD31表達量最高，CD31表達陽性的內皮細胞比例為55.8%。細胞免疫熒光進一步鑒定顯示誘導組細胞CD31表達陽性，證實MSC誘導分化為血管內皮細胞。對照組無CD31表達。

2.3 MSC誘導分化為血管內皮細胞后的功能變化 誘導第14天，DiI-Ac-LDL吞噬實驗結果顯示誘導組能夠攝取脂質，而對照組無攝取現象。誘導組具備了內皮細胞吞噬脂質的功能。Matrigel成管實驗結果顯示對照組部分細胞呈小團狀聚攏，未形成典型的線狀、管狀結構，見圖1A；而誘導14 d的細胞能夠形成典型的管狀結構，見圖1B。

注：A為對照組，B為誘導組。

圖1兩組Matrigel膠體外成管試驗結果

3 討論

隨著人們飲食結構的改變，下肢缺血性疾病的發病率逐年增高，尤其是在高齡人群，據報道70歲以上人群下肢缺血性疾病的患病率為15%～20%[4]。對于病情嚴重的患者，無論是外科搭橋還是介入腔內治療都不能從根本解決下肢缺血問題，因此臨床迫切需要新的治療手段重建血運，改善缺血。“治療性血管新生”是運用各種方法誘導、促進缺血組織血管新生或側支循環建立，以達到改善缺血的目的，其中內皮細胞增殖是血管新生的關鍵環節[5]。自體MSC因在體外分離培養方法簡單、增殖速度快、具有分化潛能、無免疫原性而備受關注[6]。如果能在體外在無血清的條件下將MSC高效、穩定地誘導分化為內皮細胞，將為臨床“治療性血管新生”提供足夠的內皮細胞，應用前景極為廣闊。

本課題沿用相關研究[7]的方法，即利用其貼附培養皿的特性，同時結合前期實驗，成功分離了MSC，可用于后續研究，且用于自體移植也避免了倫理和免疫排斥等相關問題。更為重要的是通過無血清誘導方法，可在較短時間內穩定地獲得大量內皮細胞。DiI-Ac-LDL吞噬實驗證實誘導而來的細胞具有內皮基本功能，經體外成管試驗也進一步證實誘導后的細胞具有成血管能力，可作為“治療性血管新生”的候選種子細胞。

MSC體外誘導分化形成內皮細胞的機制尚不清楚。有研究者提出，細胞所處的微環境可以影響MSC的分化方向，但是細胞微環境內成分復雜，不同的細胞微環境中存在的因子也各不相同[8]。這可能就是MSC在不同組織細胞微環境中，可向不同的細胞系分化、并獲得靶組織細胞表型的原因。如果人為模擬一個內皮細胞分化的微環境，將MSC置于該條件下培養，MSC內的內皮相關基因可能會開始表達，從而獲得內皮細胞的特征[8]。

VEGF、bFGF作為重要的血管內皮生長因子，在血管新生過程中具有協同作用，共同促進MSC向內皮細胞分化[9]。有研究只應用這兩種因子作為誘導條件，可獲得內皮細胞，但是誘導后內皮細胞的比例在既往文獻中未展示[3]。本研究采用流式細胞儀對誘導后獲得的內皮細胞進行了定量分析，顯示獲得的CD31陽性內皮細胞所占比例可高達55.8%。此外，通過VEGF、bFGF無法穩定獲得內皮細胞，可重復性差，而且我們前期只通過VEGF、bFGF也無法穩定誘導出內皮細胞。有文獻報道EGF、IGF也具有潛在的促進干細胞向內皮細胞分化的功能[10,11]，我們在無血清的EGM-2誘導培養基加入了含有VEGF、bFGF、EGF、IGF的BulletKit，誘導后的細胞在形態上呈短梭形，能夠表達內皮細胞特異性的細胞表面分子CD31，且隨誘導時間的延長其表型特征也愈加明顯。Matrigel膠體外成管實驗進一步表明誘導后的細胞具備成血管的能力。提示通過該誘導方案MSC在體外可定向分化為功能型內皮細胞。

MSC之所以向內皮細胞分化，是因為MSC具有多向分化潛能且處于特定的誘導環境，細胞周圍存在大量高濃度的誘導因子。但是，當誘導而來的內皮細胞離開誘導環境，是否能夠繼續保持內皮細胞特性。Ning等[12]進行了內皮分化的可逆性研究，發現誘導而來的內皮細胞離開誘導培養基后內皮表型會消失，當重新置于誘導培養基后，細胞又重新具備了內皮細胞特性。這種內皮分化的可逆機制以及如何讓誘導出來的內皮細胞持續保持內皮特性還有待進一步研究，這將有利于誘導而來的內皮細胞廣泛應用于臨床治療。

既往研究中MSC向內皮細胞誘導過程中往往需要添加不同比例的胎牛血清，這可能造成未知病原體的污染。本研究通過無血清EGM-2 BulletKit就能夠高效、穩定地誘導MSC分化為內皮細胞，隨誘導時間的延長內皮細胞比例增加；且進一步研究證實誘導出來的內皮細胞具有功能性，如果用于臨床治療，還可有效避免胎牛血清所帶來的潛在致病、感染風險，為“治療性血管新生”在下肢缺血性疾病的應用提供了足夠的內皮細胞來源。

參考文獻：

[1] 范忠臣，黨永康.關于下肢動脈硬化閉塞治療選擇的研究與進展[J].吉林醫學，2014,35(8):1724-1725.

[2] Grochot-Przeczek A, Dulak J, Jozkowicz A. Therapeutic angiogenesis for revascularization in peripheral artery disease[J]. Gene. 2013,525(2):220-228.

[3] Oswald J, Boxberger S, Jorgensen B, et al. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro[J]. Stem Cells, 2004,22(3):377-384.

[4] 谷涌泉.自體干細胞移植規范化治療下肢慢性缺血性疾病的專家共識[J].中華細胞與干細胞雜志,2012,2(1):1-4.

[5] Shimamura M, Nakagami H, Koriyama H, et al. Gene therapy and cell-based therapies for therapeutic angiogenesis in peripheral artery disease[J]. Biomed Res Int, 2013,2013:186215.

[6] 張凱，王毅，邢國勝.間充質干細胞的生物學特性及多向分化潛能[J].中國組織工程研究與臨床康復,2008,12(3):539-542.

[7] Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Latsinik NV, et al. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo[J]. Transplantation, 1974,17(4):331-340.

[8] 郭尚春，陳欣，袁霆，等.誘導人骨髓間充質干細胞向成骨細胞和內皮細胞分化[J]. 上海交通大學學報(醫學版),2009,29(2):154-157.

[9] Xu ZC, Zhang Q, Li H. Differentiation of human hair follicle stem cells into endothelial cells induced by vascular endothelial and basic fibroblast growth factors[J]. Mol Med Rep, 2014,9(1):204-210.

[10] Volz AC, Huber B, Schwandt AM, et al. EGF and hydrocortisone as critical factors for the co-culture of adipogenic differentiated ASCs and endothelial cells[J]. Differentiation, 2017,95:21-30.

[11] Bach LA. Endothelial cells and the IGF system[J]. J Mol Endocrinol, 2015,54(1):R1-R13.

[12] Ning H, Liu G, Lin G, et al. Fibroblast growth factor 2 promotes endothelial differentiation of adipose tissue-derived stem cells[J]. J Sex Med, 2009,6(4):967-979.