舌鱗狀細胞癌組織中Oct4、Sox2蛋白表達變化及意義

陳宏麗，柴菲，尹剛，楊敬，任曉俊(山西醫科大學汾陽學院，山西汾陽0300；山西醫科大學附屬汾陽醫院)

舌鱗狀細胞癌(TSCC)是最常見的口腔癌，其特點為惡性程度高、浸潤性生長、早期發生淋巴結轉移[1]。TNM分期可對治療前腫瘤范圍及轉移進行評估，但對TSCC的評估有局限性。因此亟需尋找新的生物學及臨床標志物對TSCC進行評估[2]。轉錄因子Oct4、Sox2被認為是胚胎干細胞轉錄調控的核心[3]，Oct4、Sox2與腫瘤干細胞(CSC)密切相關，表達Oct4、Sox2的腫瘤細胞有類似CSC的表現[4]。Oct4、Sox2在人類惡性腫瘤的發生中發揮重要作用，而在異種移植腫瘤中敲除Oct4與Sox2基因可抑制腫瘤的形成[5]。研究表明，Oct4在生殖細胞瘤、乳腺癌、宮頸癌、口腔癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌等組織中過表達[6]；且Oct4與CSC的活性和功能密切相關[7]。Sox2在肺癌、乳腺癌、結腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、腦腫瘤等腫瘤組織中高表達[8]；其與腫瘤細胞的增殖活性、生長、轉移和不良預后相關[9]。目前TSCC發生的機制尚不清楚。本研究檢測Oct4、Sox2在TSCC組織中的表達，旨在為TSCC患者的臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2007年12月～2012年1月山西醫科大學附屬汾陽醫院頜面外科手術切除的TSCC組織標本83例。患者男60例、女23例，年齡29～82(48.42±3.29)歲；WHO分類系統組織學分級為Ⅰ級38例、Ⅱ級32例、Ⅲ級13例；采用2010年國際抗癌聯盟指南進行TNM分期，Ⅰ期30例、Ⅱ期30例、Ⅲ期15例、Ⅳ期8例；有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移58例。患者入選標準：①其病理組織標本經4%甲醛液固定，常規石蠟包埋，保存完整；且臨床資料、病理資料完整。②術前未接受放化療，以手術治療為初次治療。③原發于舌部，臨床與病理檢查均確診為TSCC。排除標準：遠處轉移。另選15例舌部非腫瘤手術患者舌正常黏膜組織作為對照。患者男12例、女3例，年齡25～78(46.58±2.96)歲。兩者性別、年齡具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，參與者均簽訂知情同意書。

1.2 組織中Oct4、Sox2蛋白表達檢測 采用免疫組化SP法。石蠟標本常規連續切片(厚度2 μm)，脫蠟水化，用3% H2O2封閉10 min，PBS緩沖液浸泡，放入含EDTA的沸水中加熱行抗原修復，冷卻至室溫，滴加一抗(Oct4的一抗濃度為1∶100、Sox2的一抗濃度為1∶200，各1～2滴)，4 ℃冰箱過夜；PBS清洗后滴加羊抗鼠IgG聚合物二抗，DAB顯色液顯色，蘇木素復染，乙醇缸脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以已知陽性切片作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。由2名經驗豐富的主治醫師行獨立雙盲法閱片。結果判定：Oct4定位于細胞核，Sox2定位于細胞質，以出現棕黃色至深棕黃色顆粒為陽性。根據著色程度、陽性細胞百分比進行評分。著色為棕褐色計3分，棕黃色計2分，淡黃色計1分，基本不著色計0分；陽性細胞百分比>75%計4分，50%<陽性細胞百分比≤75%計3分，25%<陽性細胞百分比≤50%計2分，陽性細胞百分比≤25%計1分，陽性細胞百分比為0計0分。將以上兩項得分相加，計算總分(0～7分)，0～1分為表達陰性，2～7分為表達陽性。鼠抗人Oct4單克隆抗體及鼠抗人Sox2單克隆抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology Inc；快捷型酶標羊抗鼠IgG聚合物、DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計數資料組間比較采用χ2檢驗。對患者隨訪5年，記錄生存人數。生存影響因素采用COX比例風險回歸進行單因素、多因素分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TSCC組織和舌正常黏膜組織中Oct4、Sox2蛋白表達比較 TSCC組織和舌正常黏膜組織中Oct4蛋白陽性表達率分別為87.95%(73/83)、13.33%(2/15)，二者比較差異有統計學意義(P<0.05)；TSCC組織和舌正常黏膜組織中Sox2蛋白陽性表達分別為93.98%(78/83)、26.67%(4/15)，二者比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 Oct4、Sox2蛋白表達與TSCC患者臨床病理參數的關系 Oct4、Sox2蛋白陽性表達均與患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤臨床分期無關(P均>0.05)，與腫瘤組織學分級、淋巴結轉移有關(P均<0.05)。見表1。

2.3 Oct4、Sox2蛋白表達與TSCC患者生存率的關系 隨訪5年，83例患者生存48例，生存率為57.83%(48/83)。其中73例Oct4蛋白陽性表達的患者存活40例，5年生存率為54.79%(40/73)；10例Oct4蛋白陰性表達的患者存活8例，5年生存率為80.00%(8/10)；二者比較差異有統計學意義(P<0.05)。78例Sox2蛋白陽性表達的患者存活44例，5年生存率為55.13%(44/78)；5例Sox2蛋白陰性表達的患者存活4例，5年生存率為80.00%(4/5)；二者比較差異有統計學意義(P<0.05)。68例Oct4與Sox2蛋白同時陽性表達的患者存活21例，5年生存率為30.88%(21/68)；4例Oct4和Sox2蛋白同時陰性表達的患者存活3例，5年生存率為75.00%(3/4)；二者比較差異有統計學意義(P<0.05)。25例有淋巴結轉移患者存活5例，5年生存率為2.00%(5/25)；58例無淋巴結轉移患者存活43例，5年生存率為74.14%(43/58)；二者比較差異有統計學意義(P<0.05)。單因素分析：以83例患者為樣本，以患者的生存狀態為應變量，賦值：死亡(1)、生存(0)、生存期(t)，以表1所列各臨床病理參數為自變量，逐一建立COX比例回歸模型。結果顯示，年齡、性別、吸煙、飲酒、腫瘤組織學分級及臨床分期與患者總生存率無關(P均>0.05)；Oct4、Sox2蛋白表達及淋巴結轉移均與患者總生存率有關(P均<0.05)。見表2。多因素分析：建立多因素COX比例風險回歸模型，回歸過程采用后退法，設定α退出=0.05，進行自變量的選擇和剔除。結果，Sox2、淋巴結轉移兩個因素均被保留入回歸方程(P均<0.05)，提示二者為TSCC患者5年生存率的影響因素。見表3。

表1 Oct4、Sox2蛋白陽性表達與TSCC患者臨床病理參數的關系(例)

表2 TSCC患者5年生存率影響因素單因素分析

表3 TSCC患者5年生存率影響因素多因素分析

3 討論

TSCC是最常見的口腔癌類型，近幾年發病率居高不下。目前經手術及放化療等治療后患者生存率仍無明顯提高，主要原因在于TSCC浸潤性轉移較快、發現較晚[10]。研究表明，TSCC的5年生存率約為30%，3年生存率為41.12%，而單用TNM分期無法對臨床及生物學特點頻繁變異的TSCC進行評估。Tatetsu等[11]研究證實，胚胎干細胞(ESC)相關的蛋白在多種惡性腫瘤中高表達，并與腫瘤的侵襲性和不良預后相關；特別在維持ESC多能性和自我更新方面有重要作用的轉錄因子Oct4和Sox2。Zhang等[12，13]研究表明二者在體內外穩定表達能促進腫瘤細胞的生長，促進腫瘤的復發與轉移，增強腫瘤的耐藥能力，在腫瘤的發生、發展及預后中發揮重要作用。

Oct4主要作用是維持ESCs的多能性狀態，在正常成熟細胞中不表達，近來發現在口腔癌干細胞中表達。本研究中Oct4在舌正常黏膜基底層同樣表達。與舌正常黏膜組織相比，Oct4蛋白在TSCC中陽性表達率高；且Oct4蛋白陽性表達與患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤臨床分期無關，與腫瘤組織學分級相關。Oct4蛋白陽性表達率越高，腫瘤分化程度越低。表示Oct4在TSCC組織中可能促進低分化表型的TSCC細胞喪失分化能力。Oct4蛋白表達與淋巴結轉移相關，Oct4蛋白陽性表達率越高，TSCC患者越容易發生淋巴結轉移，提示Oct4可能與腫瘤的侵襲和浸潤相關，與Lopes等[14]報道一致。

Sox2屬于轉錄因子SOX基因家族，參與性別、神經發育、多種血細胞生存等發育過程的調控。項保利等[15]研究表明，Sox可調控干細胞和誘導多能干細胞。在腫瘤的發展中，Sox調控的CSC自我更新和增殖，形成各種類型癌細胞，被認為與腫瘤復發和轉移密切相關。本研究結果示，Sox2蛋白在TSCC中陽性表達率高，且與患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤臨床分期無關，與腫瘤組織學分級相關。即Sox2蛋白陽性表達率越高，腫瘤分化程度越低。Züllig等[16]研究同樣證實，Sox2具有使TSCC細胞保持低分化的能力。本研究顯示，Sox2蛋白表達與淋巴結轉移相關，Sox2蛋白陽性表達率越高，TSCC患者越容易發生淋巴結轉移，提示Sox2可能與腫瘤的侵襲和浸潤相關，這與Qiao等[17]研究結果一致。

本研究結果提示，與Oct4、Sox2蛋白陰性表達患者相比，Oct4、Sox2蛋白陽性表達的患者總生存率明顯降低。且多因素分析發現：Sox2、淋巴結轉移可作為TSCC患者總生存率的獨立預測因素。姜新娣等[18]研究結果也表明，Oct4高表達的患者生存率低。Yoshihama等[19]研究表明，Oct4和Sox2共表達譜為乳腺癌的生物學標志物。Park等[20]研究也證明其與肝癌、口腔癌的預后密切相關。因此Oct4和Sox2共表達譜在維持CSC的生物學行為方面發揮重要作用。本研究結果示：Oct4和Sox2蛋白同時陽性表達的患者總生存率低。提示聯合檢測Oct4、Sox2蛋白表達比單獨檢測可更精準地反映TSCC預后。

綜上所述，Oct4、Sox2蛋白陽性表達率越高，TSCC組織學分級越低，越容易發生淋巴結轉移，且Oct4、Sox2蛋白同時陽性表達者總生存率最低。Sox2及淋巴結轉移可作為TSCC患者總生存期的獨立預測因素，為臨床治療及檢測提供了較為可靠的方案。但是本文缺陷在于樣本量較小，下一步仍需擴大樣本量進行研究。

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