子宮內膜癌組織中Ki-67、Bcl-2、p53蛋白表達變化及意義

王輝，韓琛，董新茜，盛仲楠，李同民，李真真，王恒孝1，(1濟南大學·山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，濟南006；東昌府區婦幼保健院；山東省醫學科學院基礎醫學研究所；聊城市人民醫院；聊城市中醫院)

子宮內膜癌是常見的婦科腫瘤之一，起源于子宮內膜上皮，發病人群主要集中在圍絕經期和絕經后的女性[1，2]。近年來子宮內膜癌的發病率不斷上升，對女性的生命健康構成巨大的威脅。隨著臨床治療水平的不斷提高，早期(Ⅰ、Ⅱ期)子宮內膜癌患者的預后有明顯改善，在接受有效治療后患者5年生存率可達90%；但晚期(Ⅲ、Ⅳ期)子宮內膜癌患者的治療效果不容樂觀，患者5年生存率僅為15%[3]。子宮內膜癌患者在早期通常無明顯的特異性癥狀，部分患者直至晚期才發現病情，因此臨床治療依然較為棘手。腫瘤的發生發展與腫瘤細胞增殖、凋亡的速度密切相關。正常細胞增殖、凋亡受機體控制，而腫瘤細胞則處于失控狀態，其中多種基因、信號蛋白參與了這個過程[4，5]。增生細胞核抗原(Ki-67)是一種與細胞核增殖密切相關的抗原，其表達水平可側面反映細胞的增殖情況[6]。B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)是一種細胞凋亡相關基因，是細胞程序性死亡過程中的拮抗蛋白，能調控細胞信號途徑，延緩細胞凋亡[7]。位于人類17號染色體短臂上p53基因是細胞內一種重要的腫瘤抑制基因，能讓受損細胞停滯于G1或G2期進行修復，同時還可誘導變異細胞凋亡[8]。本研究探討Ki-67、Bcl-2及p53蛋白在子宮內膜癌組織中的表達變化及臨床意義，以期為臨床診斷子宮內膜癌及預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2017年6月聊城市東昌府區婦幼保健院與聊城市人民醫院收治的子宮內膜癌患者60例，收集術中切除的癌組織作為觀察組。患者年齡35～70(51.34±6.75)歲；臨床分期為Ⅰ期10例、Ⅱ期27例、Ⅲ期21例、Ⅳ期2例；分化程度為低分化25例、中分化18例、高分化17例；有淋巴結轉移或脈管內查見瘤栓者25例，無淋巴結轉移或脈管內未查見瘤栓者35例；肌層浸潤程度≥1/2 35例，<1/2 25例。納入標準：均經病理學檢查確診[9]；預估生存期>3個月；未合并其他類型的腫瘤；未接受放化療或內分泌治療。排除標準：存在心、肝、腎等重大臟器損傷；臨床資料缺失；妊娠期或哺乳期。同期收集20例子宮肌瘤、20例單純性增生、10例復雜性增生患者的子宮正常內膜組織作為對照組。患者年齡31～65(50.14±7.15)歲。兩組年齡具有可比性。患者及其家屬對本研究知情同意。本研究獲得聊城市東昌府區婦幼保健院和聊城市人民醫院倫理委員會批準。

1.2 組織中Ki-67、Bcl-2及p53蛋白表達檢測 采用免疫組化染色技術。病理組織在離體后即刻進行處理，采用10%的甲醛固定，行常規石蠟包埋切片。取切片，熱處理融化石蠟(60 ℃)，依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液中各6 min，再依次浸入100%、95%、80%、70%的乙醇中各5 min，自來水沖洗10 min。滴加適量的3% H2O2，封閉20 min去除內源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗3次，各3 min。浸入枸櫞酸鈉緩沖液中，采用高壓鍋進行抗原熱修復。自然冷卻后浸入10%的山羊血清封閉15 min，甩去切片表面的封閉液(勿洗)，滴加稀釋好的一抗(Ki-67、p53多克隆抗體均購于福州邁新生物技術開發有限公司，Ki-67稀釋濃度1∶200，p53稀釋濃度1∶100；Bcl-2購于北京中杉金橋生物技術有限公司，即用型)，37 ℃孵育2 h，PBS緩沖液沖洗2次，各5 min。滴加二抗(羊抗兔IgG，購于福州邁新生物技術開發有限公司)，37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗2次，各5 min。滴加HRP標記的親和素，37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗2次，各5 min。DAB顯色，自來水緩慢沖洗10 min，蘇木素溶液復染3 min，PBS返藍5 min。依次浸入80%、95%、100%、100%的乙醇中，各3 min，后浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中，各5 min，中性樹膠封片，晾干。結果判定：采用顯微鏡在高倍鏡(×400)下觀察，Ki-67及p53于細胞核呈現棕黃色為陽性表達，Bcl-2于細胞質呈現棕黃色為陽性表達。隨機選取5個視野，統計每個視野的陽性細胞百分比，計算平均值。對陽性細胞百分比與染色強度進行評分。若無陽性細胞計0分，陽性細胞百分比<10%計1分，若10%≤陽性細胞百分比≤50%計2分，陽性細胞百分比>50%計3分；若無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。兩項得分總和<3分為陰性，≥3分為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計數資料以率表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組Ki-67、Bcl-2及p53蛋白表達比較 觀察組Ki-67、Bcl-2及p53蛋白陽性表達率分別為63.33%(38/60)、80.00%(48/60)、56.67%(34/60)；對照組Ki-67、Bcl-2及p53蛋白陽性表達率分別為30%(15/50)、52%(26/50)、0。觀察組Ki-67、Bcl-2及p53蛋白陽性表達率均高于對照組(P均<0.05)。

2.2 Ki-67、Bcl-2及p53蛋白表達與患者臨床病理參數的關系 子宮內膜癌組織中Ki-67蛋白陽性表達與患者年齡無關(P>0.05)，與臨床分期、肌層浸潤深度、淋巴結轉移、分化程度有關(P均<0.05)；Bcl-2蛋白陽性表達與年齡、肌層浸潤深度、淋巴結轉移無關(P均>0.05)，與臨床分期、分化程度有關(P均<0.05)；p53蛋白陽性表達與年齡、肌層浸潤深度無關(P均>0.05)，與臨床分期、淋巴結轉移、分化程度有關(P均<0.05)。見表1。

表1 Ki-67、Bcl-2及p53蛋白陽性與患者臨床病理參數的關系[例(%)]

3 討論

子宮內膜癌是激素依懶性腫瘤，好發于圍絕經期和絕經后女性，其發病機制至今尚未明確。研究表明其與激素刺激、遺傳因素、糖尿病、高血壓、肥胖等因素有關[9，10]。子宮內膜癌在歐美的發病率高居婦科惡性腫瘤的首位，每年的新發病例約占新發婦科惡性腫瘤病例的一半[11]。目前對于晚期子宮內膜癌患者仍無高效的治療方案，治療效果和患者的預后仍然不理想[12,13]。無限增殖是腫瘤細胞的主要特點之一，正常細胞生長到相互接觸后，其運動和分裂活動均會逐漸停止，而腫瘤細胞則不受細胞接觸的影響，在體外培養時腫瘤細胞可堆積成立體細胞群。無限增殖也是腫瘤細胞易發生浸潤和轉移的重要原因[14]。細胞凋亡是指在凋亡刺激信號的作用下細胞發生程序性變性和死亡的過程。細胞凋亡對維持組織器官的正常功能和形態具有重要的作用，并且與腫瘤的發生發展密切相關。目前臨床上的放化療就是通過誘導腫瘤細胞凋亡來達到治療的目的[15]。細胞增殖、凋亡之間的動態平衡保證了機體的正常運轉，也是組織穩定的必要條件，若這種平衡被打破則可能導致腫瘤的發生，而Ki-67、Bcl-2及p53等與腫瘤細胞的增殖或凋亡密切相關[16，17]。

本研究中觀察組Ki-67、Bcl-2及p53蛋白陽性表達率高于對照組，說明在子宮內膜癌組織中Ki-67、Bcl-2及p53均呈高表達，提示腫瘤的發生、發展可能與三者的表達水平有關。進一步研究顯示，子宮內膜癌組織中的Ki-67蛋白表達與腫瘤臨床分期、肌層浸潤、淋巴結轉移、分化程度有關，Bcl-2蛋白表達與腫瘤臨床分期、分化程度有關，p53蛋白表達與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移、分化程度有關。說明子宮內膜癌組織中的Ki-67、Bcl-2及p53的表達可影響患者的臨床轉歸。臨床可通過檢測患者子宮內膜癌組織中Ki-67、Bcl-2及p53表達來評估患者的病情。丁堪鑠等[2]的研究顯示，Ki-67、p53的表達與臨床分期、淋巴結轉移有關，與本研究結果類似。Ki-67是增殖細胞中表達的DNA結合蛋白，在有絲分裂時可保護DNA結構。在細胞的分裂周期中，Ki-67在G0期不表達，在G1期、S期、G2期、M期均有不同程度的表達，M期后期Ki-67會很快消失，且Ki-67的半衰期很短，通常不會超過1 h，因此Ki-67可反映出細胞增殖的情況[18]。Ki-67表達水平越高則提示細胞增殖速率越快，因此其在腫瘤細胞中呈高表達，且與臨床分期、肌層浸潤、淋巴結轉移、分化程度有關。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其主要通過調控細胞凋亡來調控腫瘤細胞，在腫瘤細胞發生凋亡的過程中，Bcl-2可將凋亡蛋白活化因子1(Apaf-1)等定位至線粒體膜上，阻礙Apaf-1發揮凋亡作用。并且Bcl-2還可通過抑制谷胱甘肽外泄來降低胞內的氧化還原電位，多種途徑協同作用抑制腫瘤細胞的凋亡[19]。p53是一種重要的抑癌基因，可以抑制細胞生長，誘導細胞凋亡。然而在多種惡性腫瘤中50%以上的p53基因會發生不同位點、不同形式的突變，其中最為常見的是5-8外顯子點的突變，突變后的p53基因將喪失抑癌作用，轉變為癌基因，進而促進腫瘤的發展[20，21]。

綜上所述，在子宮內膜癌組織中Ki-67、Bcl-2及p53蛋白均呈高表達，且其表達水平與患者部分臨床病理參數有關。臨床可通過檢查患者子宮內膜癌組織中Ki-67、Bcl-2及p53蛋白表達來評估患者的病情。

參考文獻：

[1] Le C, He W, Yang Q. CRKL overexpression promotes cell proliferation and inhibits apoptosis in endometrial carcinoma[J]. Oncol Lett, 2017,13(1):51-56.

[2] 丁堪鑠,盧麗娜,余莉萍,等.C-erbB-2、p53、Ki-67、ER、PR在子宮內膜癌中的表達及臨床相關性[J].實用醫學雜志,2015,31(24):4069-4071.

[3] 代艷芬,滿霞霞,李佳佳,等.ER、PR、P53、Ki-67在子宮內膜癌組織中的表達及其臨床意義[J].中國婦幼保健,2016,31(8):1606-1608.

[4] Li LH, Zhang PR, Cai PY, et al. Histone deacetylase inhibitor, Romidepsin (FK228) inhibits endometrial cancer cell growth through augmentation of p53-p21 pathway[J]. Biomed Pharmacother, 2016,82:161-166.

[5] 王娟,李軍,郭燦燦.雌激素受體、孕激素受體、p53及Ki-67在子宮內膜癌組織中的表達及其與臨床病理參數的關系[J].海南醫學,2017,28(2):211-213.

[6] Deraco M, Cabras A, Baratti D, et al. Immunohistochemical evaluation of minichromosome maintenance protein 7 (MCM7), topoisomerase Ⅱ, and Ki-67 in diffuse malignant peritoneal mesothelioma patients using tissue microarray[J]. Ann Surg Oncol, 2015,22(13):4344-4351.

[7] Allen JE, Prabhu VV, Talekar M, et al. Genetic and pharmacological screens converge in identifying FLIP, BCL2, and IAP proteins as key regulators of sensitivity to the TRAIL-inducing anticancer agent ONC201/TIC10[J]. Cancer Res, 2015,75(8):1668.

[8] Nguyen TT, Hachisuga T, Urabe R, et al. Significance of p53 expression in background endometrium in endometrial carcinoma[J]. Virchows Archiv, 2015,466(6):695-702.

[9] 張洪濤,顧振鵬,薄其美,等.人表皮生長因子-2、突變型p53、Ki-67在早期子宮內膜腺癌組織中的表達及意義[J].中國婦幼保健,2016,31(16):3384-3387.

[10] 李靜亞.子宮內膜癌臨床病理因素與ER、PR、p53、Ki-67相關性研究[J].齊齊哈爾醫學院學報,2017,38(5):508-510.

[11] Arfaoui A, Douik H, Kablouti G, et al. Role of p53 Codon72 SNP in breast cancer risk and anthracycline resistance[J]. Anticancer Res, 2015,35(3):1763.

[12] 夏朝暉,李文敏,何雯.子宮內膜癌PR、ER、PTEN、p53及Ki-67的表達情況及其與預后的相關性分析[J].解放軍醫藥雜志,2017,29(7):22-25.

[13] 杜寧寧,譚文舉,李洪言,等.子宮內膜癌組織中miRNA-302c的表達變化及其意義[J].山東醫藥,2017,57(35):47-49.

[14] 陳麗君,任曉麗,孫秀利,等.p53、p16、PTEN、Ki-67、p63在子宮內膜腺癌中的表達及其與預后的相關性[J].中國婦幼健康研究,2016,27(9):1157-1160.

[15] 田俠,劉愛軍,曹晨,等.分子標志物在子宮內膜癌中的表達分析[J].現代生物醫學進展,2015,15(10):1891-1894.

[16] Liu Y, Du F Y,Chen W, et al.G15 sensitizes epithelial breast cancer cells to doxorubicin by preventing epithelial-mesenchymal transition through inhibition of GPR30[J]. Am J Transl Res, 2015,7(5):967-975.

[17] Koi C, Hachisuga T, Murakami M, et al. Overexpression of p53 in the endometrial gland in postmenopausal women[J]. Menopause, 2015,22(1):104-107.

[18] Hayashi H, Beppu T, Sakamoto Y, et al. Prognostic value of Ki-67 expression in conversion therapy for colorectal liver-limited metastases[J]. Am J Cancer Res, 2015,5(3):1225.

[19] Staff TPO. Correction: Association of genetic markers in the BCL-2 family of apoptosis-related genes with endometrial cancer risk in a Chinese population[J]. PLoS One, 2015,10(1):e0117632.

[20] 盧建軍,張林燕,宋建東.P53蛋白和MGMT蛋白在子宮內膜癌中的表達及意義[J].中國婦幼保健,2015,30(8):1254-1256.

[21]Miyamoto T, Kashima H, Yamada Y, et al. Lipocalin 2 Enhances migration and resistance against cisplatin in endometrial carcinoma cells[J]. PLoS One, 2016,11(5):e0155220.