Smad真核表達質粒構建及其在小鼠T淋巴瘤細胞中的表達

王婧帆，季然，李鑫宇，陳金鈴(南通大學醫學院病原生物學系，江蘇南通226000)

Smad同源蛋白在將轉化生長因子β1(TGF-β1)信號從細胞表面受體傳導至細胞核的過程中起關鍵作用，且不同的Smad蛋白介導不同家族成員的信號轉導[1]。TGF-β1通過與絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結合，誘導Smad2和Smad3磷酸化，磷酸化的Smad2、Smad3與Smad4形成蛋白復合物，進入細胞核內調節靶基因的轉錄[2]。TGF-β1能通過誘導Smad蛋白調節叉頭/翼狀螺旋轉錄因子3(Foxp3)的表達，因此TGF-β/Smad信號通路與Foxp3的表達密切相關。Foxp3是調控調節性T細胞發育及功能的關鍵性轉錄因子[3]。Foxp3依靠其叉頭樣結構和DNA結合，并停留在細胞核內[4]。由于Foxp3的DNA結合域靠近蛋白C端，能抑制基因轉錄。因此，Foxp3能不同程度減少白細胞介素2(IL-2)、IL-4等細胞因子的轉錄活性[5]。Foxp3基因突變可引起scurfy(sf)突變小鼠中X-連鎖的淋巴細胞增生性疾病，而在人類中的突變可導致調節性T細胞的缺陷，導致免疫調節失調-多(種)內分泌病-腸病-X-連鎖綜合征[6]。Smad蛋白尤其是Smad3蛋白，作為TGF-β信號轉導器，參與調節TGF-β的活性[5]。有研究結果顯示，Smad3缺失導致Smad3-/-小鼠炎癥反應增強，同時伴有Th2和Th17型免疫應答減弱，小鼠淋巴結中Foxp3的mRNA表達下調[6]。Tardif等[7]觀察到Foxp3增強子與轉錄因子Smad3、活化T細胞核因子(NFAT)結合，提示TGF-β可能通過此位點實現對Foxp3的轉錄調節。2016年4月～2018年3月，本研究構建并鑒定pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3和pcDNA3.1-Smad4真核表達質粒，探討Smad真核表達質粒在小鼠T淋巴瘤細胞(EL4)中是否能穩定表達，為進一步探究Smad蛋白調控Foxp3表達的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 EL4細胞購自中國科學院細胞庫；Smad2購自Santa Cruz Biotechnology；Smad3、Smad4購自Cell Signaling Technology；大腸桿菌DH5α、pcDNA3.1真核表達載體、pMD19-T載體、T4連接酶、DNA聚合酶、質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒及DNA marker均購自大連TaKaRa公司；Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ及Xho Ⅰ等限制性內切酶均購自中國Fermentas公司；電轉液購自北京Engreen Biosystem公司；電擊杯購自美國BTX公司。

1.2 Smad2、Smad3、Smad4基因擴增與克隆 采用PCR技術。根據GenBank的Smad2、Smad3、Smad4基因組序列，分別設計相應的特異性引物，擴增Smad2、Smad3、Smad4基因。Smad2上游引物：5′-AAGCTTGCCACCATGTCGTCCATCTTGCCATTC-3′，下游引物：5′-GAATTCTTTGCTCTGGAATTTTTGGATAG-3′；Smad3上游引物：5′-GAATTCGCCACCATGTCGTCCATCCTGCCCTTC-3′，下游引物：5′-CTCGAGCCTGGGGTTTTCTTCTGTGGTC-3′；Smad4上游引物：5′-GAATTCGCCACCATGGACAATATGTCTAT-AACAAATACAC-3′，下游引物：5′-CTCGAGTCAGTCTAAAGGCTGTGGGTC-3′。以EL4細胞獲得的cDNA為模板，通過PCR反應擴增出目的基因Smad2、Smad3、Smad4。PCR反應總體系為50 μL，引物各1.5 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，60 ℃復性30 s，68 ℃延伸1 min，循環25次后68 ℃延伸30 min。PCR產物加“A”尾反應，72 ℃反應30 min，經1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定產物，目的片段按照DNA膠回收試劑盒說明書切膠回收。

1.3 pMD19-T載體構建 制備DH5α感受態，PCR產物與pMD19-T載體經T4 DNA連接酶連接過夜。反應體系總體積為10 μL，其中目的片段4 μL，pMD19-T 1 μL，Solution Ⅰ 5 μL。第2天取連接產物，轉化DH5α感受態細胞，于37 ℃倒置培養過夜，挑取單克隆菌落至LB液體培養基，37 ℃搖菌過夜，進行菌液PCR。挑選PCR結果陽性的菌液抽提質粒DNA進行鑒定。重組質粒置37 ℃水浴2 h，分別進行單酶切和雙酶切驗證。產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗證正確后，送由上海生工生物工程股份有限公司測序并通過DNAMAN軟件分析測序結果。

1.4 表達載體pcDNA3.1的構建 將pMD19-T重組質粒和pcDNA3.1質粒分別用限制性內切酶Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ和EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ進行雙酶切，置于37 ℃水浴2 h，經瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。純化獲得的酶切后的目的片段和pcDNA3.1載體通過T4連接酶連接，16 ℃反應過夜，反應體系：pcDNA3.1 1 μL，目的片段6 μL，5×T4 DNA ligase buffer 2 μL，T4 DNA ligase 1 μL。連接產物轉化DH5α感受態細胞，PCR鑒定為陽性的克隆通過雙酶切進行驗證后，由上海生工生物工程股份有限公司測序并通過DNAMAN軟件分析測序結果。

1.5 轉染 將EL4細胞調整至5×106/mL，加入2 μg構建好的pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA3.1-Smad4過表達質粒，電轉液(100 μL)吹打混勻，電轉儀電轉后置37 ℃、5% CO2培養箱中培養72 h。

1.6 EL4細胞中Smad2、Smad3及Smad4蛋白表達檢測 采用Western blotting法。轉染后72 h，收集EL4細胞置EP管中，離心棄上清，PBS重懸細胞，離心棄上清。加入蛋白裂解液100 μL，冰上裂解20 min。細胞經超聲破碎后，離心收集上清，檢測蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液，沸水中煮沸10 min，置于-20 ℃冰箱備用。配制10%的分離膠，行電泳。轉膜后用10%脫脂牛奶封閉PVDF膜，室溫2 h。Smad2按1∶200稀釋，Smad3、Smad4 按1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜。二抗1：5 000稀釋，室溫孵育1 h。TBST充分洗膜后，ECL顯影。

2 結果

2.1 重組質粒pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA3.1-Smad4鑒定結果 圖1A顯示，4號泳道上可見兩條清晰的條帶，其中一條與pcDNA3.1空載體(5 428 bp)的大小一致，另一條帶與第5泳道的PCR產物(Smad2)大小一致，提示pcDNA3.1-Smad2重組質粒構建成功。圖1B顯示，4號泳道上可見兩條清晰的條帶，其中一條帶與pcDNA3.1空載體(5 428 bp)的大小一致，另一條帶與第5泳道的PCR產物(Smad3)大小一致，提示pcDNA3.1-Smad3重組質粒構建成功。圖1C顯示，4號泳道上可見兩條清晰的條帶，其中一條條帶的大小與PCR產物(Smad4)的大小一致，提示pcDNA3.1-Smad4重組質粒構建成功。測序結果證實插入的Smad2、Smad3、Smad4無突變。

注：M1為λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker；1為pcDNA3.1質粒；2為pcDNA3.1-Smad重組質粒；3為pcDNA3.1-Smad重組質粒經EcoR Ⅰ單酶切產物；4為pcDNA3.1-Smad重組質粒雙酶切產物；5為菌液PCR產物；M2為DL2000 DNA Marker。

圖1Smad真核表達質粒鑒定結果

2.2 EL4細胞中Smad2、Smad3及Smad4蛋白表達變化 將構建成功的pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA3.1-Smad4質粒轉染至EL4細胞72 h后，EL4細胞中Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達上調。見圖2。

注：A為Smad2蛋白表達；B為Smad3蛋白表達；C為Smad4蛋白表達。

圖2EL4細胞中Smad2、Smad3及Smad4蛋白表達

3 討論

Smad蛋白最早從果蠅及線蟲基因篩查中鑒定出來[8,9]，是TGF-β家族受體下游的信號轉導分子。根據Smad蛋白在TGF-β信號轉導中的功能差異，分為受體調控Smad(R-Smad1/2/3/5/6)、通用Smad(Co-Smad4)及抑制型Smad(I-Smad6/7)。R-Smad能夠與受體結合并被受體磷酸化而激活；Co-Smad能夠與活化的R-Smad結合形成復合物，復合物進入細胞核結合DNA，與多種轉錄輔因子相互作用共同調控基因轉錄；I-Smad 作為R-Smad的競爭性抑制子，能負性調控TGF-β信號通路。經典的Smad信號通路通過TGF-β與絲氨酸/蘇氨酸激酶Ⅰ型和Ⅱ型受體結合發揮效應。Ⅰ型受體激酶上游存在一個富含甘氨酸/絲氨酸的G 序列，TGF-β與Ⅱ型受體結合從而磷酸化Ⅰ型受體GS區，GS區的磷酸化隨之活化Ⅰ型受體，活化的Ⅰ型受體繼而磷酸化R-Smad C末端的SXS基序中的絲氨酸。活化的R-Smad與Smad4形成蛋白復合物，隨后轉入細胞核內，與不同的Smad結合原件、DNA轉錄因子、轉錄共激活劑或共抑制劑結合，從而實現對靶基因的調控[10]。

Foxp3是調控調節性T細胞發育及功能的關鍵性的轉錄因子。TGF-β1通過誘導Smad蛋白調節Foxp3的表達[11]。有研究證實，TGF-β誘導的轉錄因子Smad3和NFAT協同作用，與Foxp3內含子中的增強子元件相結合實現對Foxp3的調控。Smad3是TGF-β1信號通路的近端分子，在Foxp3的表達中起主要作用。在野生型小鼠中TGF-β1是T細胞表達Foxp3的一個有效的誘導劑；在Smad3敲除小鼠中，Foxp3+T細胞明顯減少[12]。因此，Smad3在TGF-β1誘導的Foxp3的產生過程中起重要的調節作用[13]。在之前的研究中，Smad3和Smad4已被證實能調節由TGF-β誘導的調節性T細胞，但在Th17細胞的產生中作用不大[7]。當Smad2缺失時，TGF-β誘導的Foxp3的表達會急劇減少。小鼠脾細胞經細粒棘球蚴囊液處理后，細粒棘球蚴囊液能上調對小鼠脾臟細胞中Treg相對特異分子Foxp3的表達，而下調TGF-β1的下游信號通路Smad4的表達，兩者之間呈負相關[14]。外周血中，Smad7和Foxp3水平能提示慢性移植腎腎病的發展程度，是檢測慢性移植腎腎病的一個無創指標。Smad7可能通過某種機制調控Foxp3的表達。

本研究將提取的重組質粒pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3及pcDNA3.1-Smad4分別用限制性內切酶雙酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳。結果重組質粒經雙酶切后可見2條清晰條帶，一條與目的片段的大小一致，另一條與pcDNA3.1空載體的大小一致，提示構建的重組質粒pcDNA3.1-Smad2、pcDNA3.1-Smad3、pcDNA3.1-Smad4中有目的片段插入。DNA測序及比對結果表明，重組質粒pcDNA3.1-Smad2，pcDNA3.1-Smad3和pcDNA3.1-Smad4中的插入片段序列與目的基因的CDS區序列完全相同，進一步說明成功構建Smad2、Smad3、Smad4高表達載體。且將Smad真核表達質粒成功轉染入EL4細胞后，能誘導目的蛋白高表達。本研究為進一步探究Smad蛋白調控Foxp3表達的機制奠定了基礎。

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