HIV-1感染對人CD4+T淋巴母細胞內ITAMs/ITIMs通路的影響

莫雨曉，謝延崢，劉京，郭曉強，何金洋(廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣州510405)

艾滋病(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的一種免疫系統缺陷疾病，是人類尚未攻克的致死性疾病之一。近年來，AIDS的發病率和病死率持續攀升，抗病毒治療仍然是主要的防治手段。但抗病毒藥物價格昂貴、不良反應大、患者服藥依從性差，因此對免疫信號通路的研究越來越受到重視[1]。研究表明，免疫激活和炎癥反應是AIDS進展的主要原因[2]。而機體的免疫和炎癥調控機制主要由包含免疫受體酪氨酸激活基序(ITAMs)和免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIMs)的受體介導[3]，并通過相關受體的磷酸化發揮作用[4]。包含ITIMs的免疫受體(SHP-1、SHP-2、SHIP-1、SHIP-2)起抑制免疫的負性調節作用，包含ITAMs的受體(Zap70、Syk)則主要起激活作用[5]。在信號傳導過程中，一方面，Src酪氨酸激酶使ITIMs的酪氨酸殘基磷酸化，繼而招募包含了SH2結構域的酪氨酸磷酸酶，從而使上游或下游分子去磷酸化，導致細胞激活過程中止[6]；另一方面，Src酪氨酸激酶使ITAMs磷酸化，并為其提供一個SH2結構域的結合位點，用于結合Syk家族的非受體蛋白酪氨酸激酶，從而使免疫細胞激活[7]。蛋白酪氨酸磷酸化修飾調節大多數生物學過程，異常的蛋白酪氨酸磷酸化水平與多種人類疾病密切相關。有研究結果顯示，HIV-1感染者ITAMs/ITIMs相關受體的信號調控通路異常[7～9]，但目前未見其具體機制的系統研究。因此，2017年9月～2018年3月，本研究以感染HIV-1的人CD4+T淋巴母細胞系(M8166細胞)為體外實驗模型，探討細胞內ITAMs/ITIMs信號通路的變化，為揭示AIDS的發病機制、篩選抗HIV藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 M8166細胞(即HIV-1的敏感細胞)、人類免疫缺陷病毒BK132 HIV-1(病毒載量為5×108copies/mL)均由美國Aaron Diamond AIDS研究中心惠贈。RPMI1640培養基、胎牛血清(Gibco公司)，逆轉錄試劑盒(Thermo Scientific公司)，定量聚合酶反應PCR試劑盒(ABI公司)，TRIzol?Reagent(Ambion公司)，各基因PCR引物由上海英駿生物有限公司合成，Western blotting及IP裂解液、SDS-PAGE 5X蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司)，SHP-2抗體、SHIP1抗體、SHIP2抗體、Zap70抗體、Syk抗體、p-SHP-2抗體、p-SHIP1抗體、p-SHIP2抗體、p-Syk抗體、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(CST公司)，SHP-1抗體、p-SHP-1抗體、HRP標記抗鼠IgG(santa公司)，P-Zap70抗體(Abcam公司)，ECL發光液(Milipore公司)。5804R冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，2720普通PCR擴增儀、ABI7300/7500熒光定量PCR儀(Invitrogen公司)，1510多功能酶標儀(Thermo公司)，165-8001垂直電泳儀(BioRad公司)，C-DiGit化學發光成像儀(Li-Cor公司)。

1.2 M8166細胞培養 按1×107/mL將M8166細胞接種于細胞瓶中，于恒溫37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下進行培養，3 d換液1次。培養基組成：RPMI1640培養基補充10%的滅活胎牛血清、丙酮酸鈉(終濃度為1 mmol/L)、L-谷氨酰胺(終濃度為2 mmol/L)、1%非必需氨基酸。

1.3 HIV-1感染 將對數生長期的M8166細胞接種于24孔板中，分別設置空白組和病毒組。空白組常規培養，不作特殊處理；病毒組以10 TCID50/mL的HIV-1進行感染，培養3 d后，收集細胞或提取蛋白。

1.4 M8166細胞內ITAMs/ITIMs通路相關受體基因表達檢測 采用RT-PCR法。提取細胞總RNA：收集細胞，加入TRIzol 500 μL以使其充分裂解；提核酸時加入氯仿0.1 mL，吹勻后靜置10 min，以4 ℃、13 000 r/min離心15 min，將無色上清液吸至新的無酶EP管中。加入異丙醇250 μL，顛倒混勻，13 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清后加入75%的乙醇500 μL，再以13 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清，再離心1 min，吸凈液體，管底白色沉淀即為所得細胞總RNA，用DEPC水10 μL溶解沉淀，吹勻。根據Thermo公司的反轉錄試劑盒說明書制作逆轉錄體系，然后置于PCR擴增儀進行逆轉錄。制作PCR反應體系25 μL，反應條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。目的基因與內參基因的比值即為目的基因相對表達量。基因引物通過美國ABI Primer Express 3.0軟件設計。SHP-1產物片段為130 bp，上游引物序列為5′-GACAAGGAGAAGAGCAAGGGT-3′，下游引物序列為5′-GGCACTCCTAGGTTCAGGTTG-3′；SHP-2產物片段為125 bp，上游引物序列為5′-TTGTTCTTTCTGTGCGCACTG-3′，下游引物序列為5′-ATCAAACCGTTCTCCTCCACC-3′；SHIP-1產物片段為134 bp，上游引物序列為5′-GGAAGGAGCAGGAAATCAGCT-3′，下游引物序列為5′-GCTTAACTGTGGCTGGTGATG-3′；SHIP-2產物片段為150 bp，上游引物序列為5′-GTGCCTATTTATTGGGGATCTGC-3′，下游引物序列為5′-AACAGGACAGCACCAGAGTAAC-3′；Zap70產物片段為122 bp，上游引物序列為5′-CACCCGAATGCATCAACTTCC-3′，下游引物序列為5′-CTCCGGCCCTTTCATCTTCTT-3′；Syk產物片段為136 bp，上游引物序列為5′-CAAGGGGCTAGCTGGATTTGT-3′，下游引物序列為5′-GGCCCGATGAGTAACAAATGC-3′。

1.5 M8166細胞內ITAMs/ITIMs通路相關受體蛋白和磷酸化蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將細胞收集至EP管中，以800 r/min、4 min離心，棄上清，用4 ℃預冷的PBS清洗3次以洗凈殘余的培養基，然后加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液400 μL，再以超聲破碎儀裂解細胞，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清，即為所得細胞蛋白。以BCA法進行蛋白定量，調平蛋白上樣濃度，同時以4∶1的比例加入5×上樣緩沖液，煮沸變性。每孔上樣總蛋白量為40 μg，經SDS-PAGE凝膠電泳(恒壓120 V，80 min)后，制備“三明治夾心”，進行轉膜(恒壓100 V，100 min)，轉膜結束后，取下PVDF膜，用TBST洗膜5 min，以5%脫脂牛奶在搖床封閉1 h，封閉完成后用TBST洗膜3次，每次5 min，再根據各抗體說明書，摸索條件，最終以SHP-1(1∶200)、p-SHP-1(1∶200)、SHP-2(1∶1 000)、p-SHP-2(1∶1 000)、SHIP1(1∶1 000)、p-SHIP1(1∶1 000)、SHIP2(1∶1 000)、p-SHIP2(1∶1 000)、Syk(1∶1 000)、p-Syk(1∶1 000)、Zap70(1∶2 000)、p-Zap70(1∶500)、GAPDH(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜。孵育一抗后，洗膜3次，每次5 min，洗去未結合一抗，然后二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，洗膜3次，每次5 min。將ECL發光液A、B底物以1∶1等量混勻后滴加于PVDF膜上，然后在化學發光成像儀中顯影。使用Image J軟件測定條帶灰度值。目的條帶灰度值/內參條帶灰度值即為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 HIV-1感染對M8166細胞內ITAMs/ITIMs通路相關基因表達的影響 與空白組比較，病毒組SHP-1 mRNA相對表達量高(P<0.01)，SHIP1 mRNA相對表達量低，但差異無統計學意義(P>0.05)；兩組SHP-2、SHIP2、Zap70、Syk mRNA相對表達量比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 兩組ITAMs/ITIMs通路相關基因相對表達量比較

2.2 HIV-1感染對M8166細胞內ITAMs/ITIMs通路相關蛋白表達的影響 與空白組比較，感染組SHP-1、p-SHP-1蛋白相對表達量高(P均<0.05)，SHIP1、p-SHIP1蛋白相對表達量低(P均<0.05)，Syk蛋白相對表達量高、p-Syk蛋白相對表達量低，但差異無統計學意義(P均>0.05)；兩組SHP-2、SHIP2、p-SHIP2蛋白相對表達量比較差異無統計學意義(P均>0.05)；兩組均未見p-SHP2、Zap70、p-Zap70蛋白表達。見表2、3。

表2 兩組ITAMs/ITIMs通路相關蛋白表達比較

表3 兩組ITAMs/ITIMs通路相關磷酸化蛋白表達比較

3 討論

自20世紀80年代AIDS被發現以來，各國都投入了大量資金和科研人才對HIV進行研究。盡管如此，目前AIDS仍是危害全人類健康的一種致死性疾病。CD4+T細胞是HIV-1感染的主要靶細胞。M8166細胞是CD4+T淋巴細胞的一種，為T淋巴母細胞系，被HIV-1感染后能夠產生明顯的細胞病變[10，11]。M8166細胞是對HIV/猴免疫缺陷病毒(SIV)最為敏感的細胞系之一[12]，常用于與HIV/SIV相關的分子病毒學研究[13]。本研究選用感染HIV-1的M8166細胞為實驗模型，可更準確地模擬人體感染HIV-1后的免疫環境，具有安全、高效、經濟、便利等特點，特別適用于HIV-1感染后免疫調控通路的相關研究。

由頓挫型感染引發的細胞焦亡是HIV-1感染導致CD4+T細胞死亡的主要方式[14～16]。細胞焦亡是新近發現的一種依賴炎性Caspase(Caspase-1)發生的細胞程序性死亡。這種死亡方式由微生物感染誘導，也可由內源性損傷相關信號引發，在傳染性疾病和免疫性疾病中扮演重要角色[17～19]。HIV-1感染機體后，體內腸道黏膜損傷，大量CD4+T細胞死亡，微生物移位，脂多糖水平升高，從而引發免疫活化和炎癥狀態。這是HIV-1感染者機體內持續過度炎癥反應的重要原因[15]。因此，細胞焦亡是一種促免疫激活、促炎癥的細胞死亡形式，AIDS疾病進展與細胞焦亡密切相關。

在接受高效抗逆轉錄病毒治療(HARRT)的HIV-1感染者的自然殺傷細胞和巨噬細胞中發現，包含ITAMs的受體λ表達降低[8，9]，但未對感染者ITAMs/ITIMs的異常有深入闡釋。由包含ITAMs/ITIMs的受體所介導的免疫激活和炎癥調控機制可以調節HIV-1感染導致的劇烈炎癥反應，使其不至于過度反應而傷害自身，而AIDS的發生發展正是由HIV-1感染引發的持續過度免疫激活和炎癥反應導致。目前關于HIV-1感染造成的細胞焦亡的研究報道較少，其免疫調控通路的作用機制更未見報道，而深入研究ITAMs/ITIMs免疫信號調控通路異常的機制與細胞焦亡的內在關系，可進一步闡明HIV-1感染者炎癥反應持續過度的機制，為AIDS治療開辟除HARRT法以外的新途徑。

本研究結果顯示，HIV-1感染M8166細胞后，細胞內SHP-1 mRNA表達升高，SHP-1、P-SHP-1蛋白表達上調，而SHIP1 mRNA表達有下降趨勢，SHIP1、P-SHIP1蛋白表達降低。表明細胞感染HIV-1后，ITAMs/ITIMs信號調控通路被部分激活，并可能通過促進SHP-1的表達及磷酸化或抑制SHIP1的表達及磷酸化發揮作用，使疾病進一步發展。提示HIV-1感染造成的CD4+T細胞焦亡可能通過ITAMs/ITIMs信號通路發揮作用。

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