離體豬肝膽道內射頻消融時毗鄰膽道熱休克蛋白70表達情況

楊 超，盧 偉，馬軍朋，楊 劍，蔣富強，杜 鵬，張嘉誠，解 鵬，張 哲

惡性膽道梗阻是由膽管癌、胰頭癌、肝癌等惡性腫瘤引起的膽汁引流不暢所致的惡性黃疸。使用雙極射頻消融導管(HabibTMEndoHPB)行膽管內消融疏通已堵塞的膽道并植入金屬支架，取得了較長時間的高開通率，同時對膽道支架植入術后再次堵塞的患者還可再行消融治療[1-5]。作者前期研究證實膽道內熱消融時因為膽汁的局部溫度升高，其熱量可能通過膽汁傳遞至毗鄰非消融膽管內，但在常規消融參數下毗鄰非消融區膽管未見明顯損傷[6]。熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一組生物體內普遍存在、進化上高度保守的蛋白質家族，又被稱為分子伴侶。大量資料表明，在應激狀態下HSP70參與細胞的抗損傷、修復和熱耐受過程，是一種保護性蛋白，受到高溫等惡劣環境襲擊時，組織就會大量合成[7]。本研究利用免疫組織化學方法檢測膽管內射頻消融后毗鄰膽管HSP70的表達水平，并探討不同消融功率下毗鄰消融靶區的膽管組織內HSP70表達的差異及意義。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物器官：15例健康本地長白豬新鮮離體豬肝，均保留有完整的膽囊及中上段膽總管；②器械：包括經皮穿刺式雙極射頻導管HabibTMEndoHPB(英國EMcisio公司)、超滑導絲(0.035 inch，日本Terumo公司)、單彎導管(5Fr，上海Cordis公司)；③儀器：數字減影血管造影機(digital subtraction angiography，DSA)(AlluraXper FD20,荷蘭Philips公司)，射頻發生儀(Model 1500X,美國Rita Medical Systems公司)，SP試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；④實驗藥品：對比劑(碘佛醇370)，人膽汁(提前自膽道梗阻患者膽道引流管內收集)。

1.2 方法

1.2.1 建立人膽汁充盈離體豬肝膽道系統消融模型 將新鮮離體豬肝放置于DSA手術臺上，仔細查看確保膽道系統完好無損。使用注射器經膽總管緩慢注入提前收集好的人膽汁，在DSA透視下經膽總管引入超滑導絲，然后置入5Fr單彎導管，退出導絲后注入碘佛醇造影，證實膽道系統完整無損傷。經單彎導管引入導絲后撤出導管，于DSA透視下經導絲插入HabibTMEndoHPB射頻消融導管至膽總管上端近肝門區并用縫線將消融導管與膽總管綁緊，防止膽汁滲漏(圖1)，并連接好射頻發生儀。

A：射頻消融導管插入新鮮離體豬肝肝門區膽管內；B：經消融導管造影證實膽道系統完好

1.2.2 離體豬肝膽管內消融及免疫組化染色 15個新鮮離體豬肝隨機分為3組、每組5個，所有豬肝均消融120 s，第1、2、3組分別采用10 W、12 W、14 W功率消融，消融后取距遠端消融電極1 cm、2 cm處膽管組織。鼠抗HSP70單克隆抗體(1∶50)，操作嚴格按照試劑盒說明進行。3，3-二氨基苯聯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，采用S-P法對全部標本進行免疫組化染色，染色前使用微波爐進行抗原修復。用已知陽性組織切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照。

1.2.3 結果判定 觀察到黃色或棕黃色顆粒時判定為陽性結果，隨機觀察100個細胞，HSP70的染色結果(表達強度)分為3級。1級，陽性細胞數<30%，染色顆粒淺黃、細小、成堆；2級，陽性細胞數為30%～60%，染色顆粒深黃、粗大、成片；3級，陽性細胞數>60%，染色顆粒棕黃、粗大、成片[7]。

1.3 統計學處理 應用SPSS 21.0統計軟件，分別采用Spearman相關分析及Wilcoxon秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 消融模型建立 本研究中，人膽汁充盈離體豬肝膽道系統消融模型均成功建立(圖1A、B)。15例豬肝共30例膽管組織HSP70表達強度記錄見表1。

2.2 膽管組織HSP70表達強度 消融區域膽管壁大體肉眼觀呈灰黃色至深黃色改變，管壁周圍可見膽汁滲入膽管壁，毗鄰膽管壁未見明顯變化(圖2)。距遠端消融電極1 cm處膽管組織HSP70表達強度：1級染色4例(26.7%)，2級染色6例(40%)，3級染色5例(33.3%)；距遠端消融電極2 cm處膽管組織HSP70表達：1級染色10例(66.7%)，2級染色4例(26.7%)，3級染色1例(6.6%)。不同消融功率與HSP70表達強度結果見表1。

表1 消融功率與HSP70表達強度

消融功率越高，消融區毗鄰膽管(距遠端消融電極1 cm)HSP70表達強度越強，兩者呈明顯正相關(r=0.755，P<0.001)；距遠端消融電極1 cm處膽管組織HSP70表達強于距遠端消融電極2 cm處的表達(Z=-2.334,P<0.05，表2)，越靠近消融區域的膽管越可能受到消融熱量的影響損傷，從而HSP70大量快速表達以修復熱損傷(圖3)。

使用14 W功率消融120 s后消融區膽管壁深黃色，膽汁滲入肝組織；距消融區1、2 cm處膽管壁顏色未見明顯變化

表2 取材位置與HSP70表達強度

注：Z=-2.334,P<0.05

使用14 W功率消融120 s后取距消融區1 cm處膽管組織行免疫組化檢測，可見多數膽管上皮細胞核及胞漿中出現深黃色顆粒，HSP70表達強度判定為2級(HE染色，×400)

3 討論

近年來膽管內射頻消融治療惡性膽道梗阻已逐漸應用于臨床，并取得了較滿意的療效[5，8-9]。作者前期研究證實膽管內射頻消融所產生的熱量會經膽管內膽汁傳遞至毗鄰消融區的正常膽管，病理切片證實不會損傷正常膽管及毗鄰肝組織。大量資料表明，組織在應激狀態下HSP參與細胞的抗損傷、修復和熱耐受過程，是一種保護性蛋白，受到高溫等惡劣環境襲擊時，組織就會大量合成[10-12]。本研究發現膽管內射頻消融后，毗鄰消融區的膽管組織出現HSP70的表達，且表達強度與消融功率呈正相關。說明膽管內射頻消融時，產生的熱量會使毗鄰正常膽管組織出現應激狀態，合成HSP70以抗熱損傷并進行修復。隨著功率的增加，熱量經膽汁傳遞至鄰近組織增多，誘導產生的HSP70不足以抵抗熱損傷時，毗鄰消融區的正常膽管則可能首先出現可逆性的熱損傷，如組織出血、水腫等炎性反應。當消融功率及消融時間繼續增加時，毗鄰消融區的正常膽道則可能出現不可逆的熱損傷，從而造成毗鄰正常膽道狹窄、攣縮或膽瘺等并發癥。

據文獻報道,HSP70在腫瘤免疫中亦發揮重要作用,HSP70不僅參與腫瘤抗原的加工呈遞,而且可作為抗原呈遞分子直接將腫瘤抗原肽呈遞給T細胞,激發T細胞介導的特異腫瘤細胞免疫[13-15]。因此，當進行膽道內射頻消融治療惡性膽道梗阻，且未出現毗鄰膽管組織不可逆性熱損傷時，其所產生的HSP70不僅可以抵抗射頻消融所產生熱量經膽汁傳遞造成的熱損傷，并且可能對腫瘤免疫發揮一定作用。

總之，本研究結果表明，膽管內射頻消融可導致消融區毗鄰膽管組織HSP70表達，遠離消融區域膽管(距離遠端消融電極≥2 cm)HSP70表達無明顯增多；隨著消融功率的增加，毗鄰消融區膽管組織內HSP70表達強度亦隨之增加。因此，在目前臨床常規應用消融參數下，經皮肝穿膽管內射頻消融對消融區毗鄰正常膽管組織是安全可靠的，但隨著消融功率的增加則可能對毗鄰正常膽管產生熱損傷。本研究使用新鮮離體豬肝，膽囊及中上段膽總管內的膽汁是不流動的，后續可在此研究基礎上建立活體動物實驗模型，從而更為準確模擬臨床實際、評估膽道內射頻消融后毗鄰正常膽管損傷情況。

【參考文獻】

[1]Shepherd HA,Royle G,Ross AP,et al.Endoscopic biliary endoprosthesis in the palliation of malignant obstruction of the distal common bile duct:a randomized trial[J].Br J Surg,1988,75(12):1166-1168.

[2]Dolak W,Schreiber F,Schwaighofer H,et al.Endoscopic radiofrequency ablation for malignant biliary obstruction:a nationwide retrospective study of 84 consecutive applications[J].Surg Endosc,2014,28(3):854-860.

[3]Steel AW,Postgate AJ,Khorsandi S,et al.Endoscopically applied radiofrequency ablation appears to be safe in the treatment of malignant biliary obstruction[J].Gastrointest Endosc,2011,73(1):149-153.

[4]Wynn RM,Davie JR,Cox RP,et al.Molecular chaperones:heat-shock proteins,foldases,and matchmakers[J].J Lab Clin Med,1994,124(1):31-36.

[5]楊超,盧偉.經皮肝穿刺膽道內射頻消融聯合膽道支架與單純膽道支架治療惡性膽道梗阻的效果對比[J].中國醫藥導報,2016,13(28):99-102.

[6]楊超,盧偉.離體豬肝膽道內射頻消融時局部膽汁溫度及膽道損傷情況[J].中國介入影像與治療學,2016,13(2):107-110.

[7]Wang Y,Cui ZH.Relationship and significance of the expression of p15 and hsp70 genes in hepatocellular carcinoma[J].Chin J Clin Oncol Rehabil,2004,11(6):494.

[8]申淑群,楊業發,張一軍,等.經皮肝穿刺膽管內射頻消融聯合金屬支架植入治療惡性膽道梗阻的短期療效及安全性[J].介入放射學雜志,2014,11:969-971.

[9]陳柱,徐克,肖恩華.經皮肝穿刺膽道腔內射頻消融治療惡性膽道梗阻安全性的研究進展[J].介入放射學雜志,2015,12:1119-1122.

[10]Wang XP,Wang QX,Lin HP,et al.Recombinant heat shock protein 70 functional peptide and alpha-fetoprotein epitope peptide vaccine elicits specific anti-tumor immunity[J].Oncotarget,2016,7(44):71274-71284.

[11]Zhe Y,Li Y,Liu D,et al.Extracellular HSP70-peptide complexes promote the proliferation of hepatocellular carcinoma cells via TLR2/4/JNK1/2MAPK pathway[J].Tumor Biol,2016,37(10):1-9.

[12]Wang C,Zhang Y,Guo K,et al.Heat shock proteins in hepatocellular carcinoma:molecular mechanism and thera-peutic potential[J].Int J Cancer,2016,138(8):1824-1834.

[13]Udono H,Srivastava PK.Heat shock protein70-associatedpeptidees elicit specific cancer immunity[J].J Exp Med,1993,178(10):1391.

[14]Huang C,Yu H,Wang Q,et al.A novel anticancer approach:SEA-anchored tumor cells expressing heat shock protein 70 onto the surface elicit strong anticancer efficacy[J].Immunol Lett,2005,101(1):71-80.

[15]Srivastava PK.Identification of chaperones as essential components of the tumor rejection moieties of cancers[J].Cancer Immun,2011,12(12):5.