喜勒可吸收生物修復膜治療下頜角區骨缺損實驗研究

張自強，丁 芳，張以河，安 琪，徐榮榮，劉明東

引導骨再生(guided bone regeneration,GBR)技術采用生物膜阻擋周圍軟組織的成纖維細胞進入骨缺損區，保護缺損區具有成骨能力的血凝塊的穩定，維護血塊充填的間隙，最終實現缺損區的骨修復再生[1-2]。成骨過程中具有成骨潛能的細胞向缺損區生長、移行的速度慢于周圍的結締組織，可吸收生物修復膜的存在機械性地阻礙了纖維結締組織和周圍軟組織進入骨缺損部位，保持骨缺損部位具有成骨潛能的間質細胞具有相對穩定的生長環境[3-4]?？晌丈镄迯湍ぷ鳛楣侨睋p修復的關鍵材料，臨床上最早應用于引導牙周缺損的修復與再生，如種植牙前種植區骨量不足；即刻種植時種植體與拔牙創之間有間隙；種植時出現骨裂及種植體暴露；種植術后種植體周圍炎癥引起的病理性骨吸收等[5-6]。膠原作為天然的生物材料，廣泛的應用于組織工程和再生醫學中[7]。喜勒可吸收生物修復膜以牛跟腱為原料，采用酶解、透析、體外分子自組裝、滅菌等工藝制得。本研究旨在對比喜勒可吸收生物修復膜與市售生物修復膜修復骨缺損的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新西蘭大白兔由北京金牧陽試驗動物養殖有限責任公司提供[SCXK-(京)-2015-0005]。共選取健康成年新西蘭大白兔12只，體重2～2.5 kg，雌雄不限，單籠喂養，自由飲水進食，在實驗室飼養1周后進入實驗。實驗動物手術前1天禁食(不禁水)。

1.1.2 儀器和設備 喜勒可吸收生物修復膜由北京湃生生物科技有限公司生產(批號20160720)。市售生物修復膜為國家食品藥品監督管理總局已批準的市售生物修復膜(批號160317-SS160102)。

1.2 方法

1.2.1 手術方法 新西蘭大白兔稱重后用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg經耳緣靜脈滴注，全身麻醉。將兔仰臥位固定在手術臺上，下頜角試驗區用剪刀去毛。用2.5%的碘伏和75%的酒精進行常規皮膚消毒鋪巾，無菌條件下，在下頜角區下緣做3 cm長的皮膚切口并切透骨膜，貼骨面向上剖離咬肌與翼內肌，充分暴露下頜角手術區[8]。

1.2.2 自體骨髂骨取骨 為保持髂嵴的外形和完整性，骨切口采取髂嵴上H型開窗術，暴露松質骨，用挖匙挖出塊狀松質骨，鋼絲剪剪碎，無菌紗布包好待用，用可吸收線將髂嵴復位，皮下及皮膚逐層縫合，加壓包扎。

1.2.3 骨缺損模型的建立 在生理鹽水充分冷卻的條件下，采用直徑為6 mm的球鉆在兔下頜骨左右兩側下頜角區分別制備直徑6 mm洞穿性的骨缺損。覆蓋生物膜，需超出缺損邊緣2 mm，分層縫合創口。術后3 d每天皮下注射抗生素。分別于術后1個月、3個月采用空氣栓塞法處死實驗兔，取整個下頜骨。

1.2.4 骨缺損模型的分組 12只兔子分為2組：喜勒可吸收生物修復膜組6只(左側植入自體骨覆蓋喜勒可吸收生物膜，右側不植骨不覆膜作為空白對照)，分別在1個月時間點、3個月時間點處死3只實驗兔取下頜骨；市售生物膜組6只(左側不植骨不覆膜作為空白對照，右側植入自體骨覆蓋市售生物膜)，分別在1個月時間點、3個月時間點處死3只實驗兔取下頜骨。

1.3 觀察方法 肉眼觀察皮膚創口愈合情況，解剖觀察創口處感染情況；X線觀察：對處理過的下頜骨進行X光拍攝，并對X線圖像進行處理，以便較直觀地反映骨缺損愈合情況；組織學觀察：常規石蠟包埋，脫鈣切片，Masson染色，光鏡下觀察。

2 結果

2.1 肉眼觀察 1個月時，6只兔子下頜骨表皮創口愈合良好，無感染現象，解剖時發現下頜骨膜植入位置創口愈合良好，無感染粘連現象；3個月時，毛已恢復正常長度，兔子下頜骨表皮創口愈合良好，下頜骨膜植入材料位點恢復良好。說明喜勒可吸收生物膜與市售生物修復膜生物相容性良好，不會引起機體炎性反應(圖1)。

A：1個月時表皮傷口愈合良好；B：1個月時下頜角肌肉區創口愈合良好；C：3個月時表皮傷口愈合良好；D：3個月時下頜角肌肉區創口愈合良好圖1 新西蘭大白兔下頜角解剖圖

2.2 X線觀察 從X光圖片可以看出，植入材料1個月后喜勒可吸收生物修復膜組和市售生物修復膜組的大白兔下頜骨孔洞都有不同程度的縮小，說明缺損處都有不同程度的新骨生成，骨生成情況無明顯區別。但與空白對照相比，覆膜下頜骨孔洞明顯縮小(圖2)。

A：喜勒可吸收生物修復膜組左側下頜骨新生骨組織已覆蓋鉆孔；B：空白對照組左側下頜骨孔洞明顯；C：市售生物修復膜組右側新生骨組織已覆蓋鉆孔；D：空白對照右側下頜骨孔洞明顯

3個月時，喜勒可吸收生物修復膜組敷膜處骨缺損區消失，市售生物修復膜組敷膜處骨缺損消失，空白對照缺損區無明顯變化。表明使用喜勒可吸收生物修復膜與市售生物修復膜后，經過3個月的修復生長，新生骨進一步增加，骨缺損已基本愈合，說明喜勒可吸收生物修復膜與市售生物修復膜都可以阻擋肌肉組織長入骨缺損部位，并引導骨缺損修復再生(圖3)。

A:喜勒可吸收生物修復膜組左側下頜骨新生骨組織已覆蓋鉆孔;B:空白對照左側下頜骨孔洞明顯;C:市售生物修復膜組右側新生骨組織已覆蓋鉆孔;D:空白對照右側下頜骨孔洞明顯

2.3 組織學檢查 取下頜角部位，剔除部分肌肉組織，以10%中性福爾馬林固定，50%甲酸室溫下脫鈣處理，然后石蠟固定，脫鈣切片，Masson染色，光鏡下觀察生物膜吸收、降解情況及骨缺損愈合情況，顯微鏡下觀察(圖4)。

從圖中可以看出，植入材料1個月時，4倍鏡下喜勒可吸收生物修復膜結構完整，緊貼骨組織，將骨缺損區與肌肉組織隔離，無炎性細胞。10倍鏡下喜勒可吸收生物修復膜結構清晰，膜結構內及周圍無炎性細胞。植入材料3個月時，喜勒可吸收生物修復膜消失，骨缺損區修復良好，無炎性細胞。

植入材料1個月時，4倍鏡與10倍鏡下市售生物修復膜消失，缺損區無炎性細胞，植入材料3個月時，骨缺損區修復良好，無炎性細胞。

1個月時喜勒可吸收生物修復膜膜結構依然完整，但市售生物修復膜已經消失。說明喜勒可吸收生物修復膜與市售生物修復膜生物相容性良好，但喜勒可吸收生物膜較市售生物修復膜抗降解能力強。

喜勒可吸收生物修復膜組左下頜角區，鉆孔內植入自體骨覆蓋喜勒可吸收生物修復膜，骨缺損區域具有類骨質生成，類骨質表面具有一層到多層成骨細胞；市售生物修復膜組右下頜角區，骨缺損區填充自體骨覆蓋市售生物修復膜，骨組織修復良好，骨缺損區已連接植入自體骨，骨內膜和外膜層整齊排列一層呈柱狀成骨細胞；空白對照左下頜角區，斷骨區明顯；空白對照右下頜骨區骨缺損區域明顯，骨缺損區內被膠原纖維或成纖維細胞填充，無骨質樣結構形成。

植入材料1個月時，喜勒可吸收生物修復膜與市售生物修復膜引導骨再生能力無明顯區別，骨缺損區都已連接植入自體骨并有類骨質生成。覆蓋喜勒可吸收生物修復膜的骨缺損區內有成骨細胞生成，而空白對照骨缺損區內被膠原纖維或成纖維細胞填充，無成骨細胞。說明喜勒可吸收生物修復膜能起到物理阻隔作用，能夠有效的引導骨再生(圖5)。

植入材料3個月時，喜勒可吸收生物修復膜與市售生物修復膜都降解完畢，2組骨缺損都修復良好，骨膜完整，骨外膜細胞為扁平狀，骨組織完整，骨基質內有一層扁平狀的成骨細胞，骨基質結構呈板層狀較為致密；空白對照斷骨區域明顯，骨缺損區被間充質細胞填充，再次說明敷蓋喜勒可吸收生物修復膜能夠起到物理阻隔作用，可良好的引導骨組織再生(圖5)。

A：1個月時4倍鏡下喜勒可吸收生物修復膜結構完整；B：1個月時10倍鏡下喜勒可吸收生物修復膜結構完整；C：3個月時4倍鏡下喜勒可吸收生物修復膜消失；D：3個月時10倍鏡下喜勒可吸收生物修復膜消失；E：1個月時4倍鏡下市售生物修復膜消失；F：1個月時10倍鏡下市售生物修復膜消失；G：3個月時4倍鏡下市售生物修復膜消失；H：3個月時10倍鏡下市售生物修復膜消失

A：1個月喜勒可吸收生物修復膜組左側下頜角區；B：1個月市售生物修復膜組右側下頜角區；C：1個月空白對照左下頜角區；D：1個月空白對照右下頜角區；E：3個月喜勒可吸收生物修復膜組左側下頜角區；F：3個月市售生物修復膜組右側下頜角區；G：3個月空白對照左下頜角區；H：3個月空白對照右下頜角區(Masson染色，×4)

3 討論

GBR技術應用了膜的屏障作用、空間保護作用、誘導引導作用，應用于牙種植，引導種植體周圍骨再生，都取得了理想的骨再生效果。GBR技術通過膜的機械屏障作用，阻止了來自周圍組織的成纖維細胞侵入骨缺損區，并通過缺損區植入材料的引導支架作用，使自體成骨細胞有足夠時間在缺損區增殖、成骨，最終達到缺損區骨組織重建。

GBR技術中應用的可吸收生物修復膜材料分為可生物降解與不可生物降解2大類，其中第一代再生膜的材料是不可降解的鈦膜、聚四氟乙烯等。這類材料易操作且具有較好的生物相容性和較理性的機械強度，但是這類膜通透性較差，影響營養物質進入上方瓣膜，易于引起牙齦退縮，從而引發感染及膜暴露，同時材料不能被組織吸收且無法與周圍組織結合，因此不可避免的要經受二次手術，增加了創傷[9-10]。第二代再生膜材料為生物可降解材料，膜材料在機體內可降解吸收，從而避免了二次手術取出?？山到馍锬げ牧嫌芯廴樗帷⒛z原、聚乙烯二醇、殼聚糖等，這些材料中，膠原膜具有纖維網架結構，有利于再生細胞附著，易于放置貼附，生物相容性好，在促進細胞的粘附、增殖和分化方面優于其他可吸收生物修復膜材料[11]，因此在各類可吸收性GBR膜中，膠原膜備受關注。目前臨床中應用較多的膠原膜為脫細胞真皮基質膜，脫細胞真皮基質膜去除了真皮的細胞成分，保留真皮內的細胞外基質，維持完整的膠原形態和基底膜結構[12]。脫細胞真皮基質膜采用Dispase-Triton法[13]或NaCl-SDS法[14]去除了基質外的細胞成分，但是膜中膠原分子內C、N末端區域的主要免疫原性位點“端肽”[15]無法去除，因此不能完全去除其免疫原性。而喜勒可吸收生物修復膜采用精準酶切技術從牛跟腱中提?、裥湍z原蛋白，其純度達99%以上，酶切去除了Ⅰ型膠原蛋白的端肽結構，徹底去除了其免疫原性。與脫細胞真皮基質膜不同，喜勒可吸收生物修復膜采用的是體外自組裝工藝，運用了膠原蛋白大分子中攜帶不同電荷的基團，氫鍵、通過靜電作用、疏水性作用等非共價鍵力自發地自組裝形成的膜[16]，這些分子鍵使其機械強度比脫細胞工藝基質膜高，組織相容性好。

可吸收性生物修復膜植入生物體后，在被吸收之前需要維持一定時間才能起到良好的修復作用，即膜的降解速率應當與組織愈合的速率保持一致。如果膜的降解時間低于骨的形成時間，骨的缺損修復效果將會大打折扣[17-18]。宋愛梅等[19]和Karring等[20]研究發現，術后2～3周是牙周再生愈合的關鍵時間，因此生物修復膜用于治療牙周病時，降解周期需要在3～4周以上，膜材料用于修復骨缺損時，其降解周期應保持17周左右時間，以平衡人類骨的正常形成周期。市售生物修復膜在植入1個月時已經消失，而喜勒可吸收生物修復膜結構依然完整，且緊貼骨組織，無炎性細胞，表明喜勒可吸收生物修復膜的降解時間更長，抗降解能力優于市售組。

喜勒可吸收生物修復膜在進行GBR時，具有很好的安全性和有效性，能夠起到生物屏障膜的作用，阻止來自周圍軟組織的成纖維細胞，讓成骨細胞有足夠的時間和空間增殖，最終達到引導組織再生、定向修復的目的，實現缺損區的骨修復再生。

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