黃芩素對結腸癌細胞PTEN、Akt及p-Akt蛋白表達的影響

宋紅群 王寧 李超彥

結腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界范圍內許多國家惡性腫瘤高死亡率的原因之一[1]，在發達國家每年影響人數超過100萬人[2]，嚴重威脅著人類健康。在我國惡性腫瘤患者中，結腸癌的發病率和死亡率均較高，發病率居惡性腫瘤發病率的第三位，僅次于肺癌和胃癌，死亡率居第五位[3]。結腸癌易復發和轉移，故其病死率較高，預后較差。盡管隨著治療手段的不斷改進，結直腸癌的治療效果得到明顯改善，但在2008年的統計中，其病死率仍達8.8%。結腸癌的腫瘤發生及復發轉移是多因素參與的復雜過程，除腫瘤細胞微環境的改變外，調節細胞周期、生長及凋亡的相關癌基因和抑癌基因表達異常在其發生過程中起著非常重要的作用[4-6]。

黃芩素屬黃酮類物質，主要來源于黃芩的根部。黃芩素具有明顯的抗炎活性，且與NF-kappaB的激活關系密切[7]。有研究表明，黃芩素能在人卵巢癌等腫瘤細胞中表現出明顯的抗腫瘤作用[8-10]。我們的前期研究顯示，黃芩素能夠影響結腸癌細胞的增生及凋亡，但其作用機制尚不清楚。本研究以人結腸癌細胞系SW620為對象，觀察不同濃度黃芩素對其細胞生長及腫瘤抑制基因PTEN(phosphatase and tensin homologue，PTEN)和Akt蛋白表達的影響，探討黃芩素的抗腫瘤作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 黃芩素，分子量270.24，黃色粉末，規格100 mg，購自sigma公司(465119)，純度≥98%，易溶于乙醇、甲醇。取黃芩素粉末10 mg，溶于甲醇中，制備成200 μmol/L的溶液備用。使用前用DMEM培養基稀釋成所需濃度加入培養細胞中。

1.2 細胞 人結腸癌細胞SW620為51歲白人來源的結腸腺癌發生轉移后的淋巴結轉移組織，購置于上海生物研究所。

1.3 其他材料 試劑低糖DMEM細胞培養基及胎牛血清購自Gibco公司(11885092，10099-141)，MTT購自sigma公司(M2128)；EdU檢測試劑盒購自Invitrogen公司(C10646)；蛋白提取試劑盒購自Calbiochem公司(539790)；DMEM培養基及胎牛血清購自Gibco公司(11885092)；Transwell小室購自美國BD公司(353093)；兔抗人多克隆PTEN、Akt及p-Akt S473抗 體 購 自 ABCam公 司 (ab32199，ab126811，ab66138)；山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司(ZB-5301)。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養 復蘇凍存的SW620細胞，于含10%胎牛血清的DMEM培養基中進行傳代培養，并放置在37℃、5%CO2恒溫培養環境中。

1.4.2 EdU染色和MTT法測定細胞增生抑制率SW620細胞常規傳代培養，收集對數期生長細胞，消化并制作成細胞懸液，調整濃度為5×104/mL，以100 μL/孔接種于96孔板，5%CO2、37 ℃培養24 h。分別加入相應的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為0、25、50、75 μmol/L，繼續培養24 h，48 h，每空加入100 μL含有濃度為50 μmol/L的EdU培養基孵育2 h，棄培養基，PBS清洗2次。每孔加入50 μL含4%多聚甲醛的固定液進行固定，室溫放置30 min。按照EdU檢測試劑盒的說明書進行EdU染色。隨后用Hoechst 33342進行細胞核復染。熒光顯微鏡下觀察并記錄。實驗重復3次。

收集對數生長期的SW620細胞，調整濃度為5×104/mL的細胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔板，5%CO2、37℃培養24 h。分別加入相應的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為0、25、50、75 μmol/L。繼續培養12 h，24 h，36 h，48 h后，每孔加濃度為5 mg/mL的MTT溶液10 μL，孵育4 h后終止后，振蕩15 min，選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度OD值，繪制生長曲線。實驗重復3次。

1.4.3 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 將Matrigel稀釋濃度為10 μg/μL后，包被Transwell小室，分隔成上下小室。將經不同濃度黃芩素處理48 h后的SW620細胞調整濃度為1×105/mL，取200 μL加入上室，下室加入600 μL的完全培養基，5%CO2、37 ℃環境下培養10 h。取出Transwell小室，并用PBS濕潤，然后用棉球擦去上室表面粘附的細胞，PBS洗滌2次。將Transwell小室用4%甲醛溶液固定15 min，乙醇脫水，結晶紫染色，顯微鏡下觀察并計數上室遷移至微孔膜下層的細胞。實驗重復3次。

1.4.4 免疫印跡Western blot檢測PTEN、Akt及p-Akt S473蛋白的表達 將濃度為5×104/mL的SW620細胞懸液以2 mL/孔的量接種于6孔培養板中，終濃度分別為0、25、50、75 μmol/L的黃芩素處理48 h后，棄去上清液，按照蛋白提取試劑盒的說明進行蛋白提取，并測定其濃度。50 μg/孔總蛋白上樣，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉膜，封閉，洗滌，PTEN、Akt、p-Akt S473，β-actin一抗孵育(1∶1 000)，4 ℃過夜，TBS洗滌3次，加入二抗(1∶5 000)孵育，洗滌，ECL顯色液顯色檢測蛋白的表達。實驗重復3次。

1.5 統計學分析 本研究中每種檢測實驗均重復3次，所有數據采用()表示，各實驗重復3次，數據均采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。統計差異通過t檢驗或單因素方差分析來進行比較，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩素能夠抑制人結腸癌細胞的增生 為觀察黃芩素對SW620細胞的影響，本研究通過MTT和EdU實驗檢測了經黃芩素作用后的腫瘤細胞的生長及增生情況(圖1～2)。EdU結果顯示，各組經0、25、50、75 μmol/L黃芩素處理24 h后處于S期的SW620細胞所所占比例分別為(58.11±5.77)%、(51.62±7.84)%、(48.75±5.44)%、(46.59±3.59)%，與0 μmol/L黃芩素處理組相比，75 μmol/L黃芩素處理組處于S期的細胞比例顯著降低(P＜0.05)；各組經0、25、50、75 μmol/L黃芩素處理48 h后處于S期的結腸癌細胞所占的比例分別為(52.16%±5.05)%、(46.40%±6.75)%、(42.21%±5.21)%、(35.37%±4.12)%，與0 μmol/L黃芩素處理組相比，75 μmol/L黃芩素處理組處于S期的細胞比例顯著降低(P＜0.01)。MTT結果顯示，黃芩素對SW620細胞具有直接抑制作用，并呈現劑量、時間依賴性。

圖1 黃芩素對SW620細胞生長的影響

圖2 不同處理組SW620腫瘤細胞的生長曲線

2.2 黃芩素能夠抑制人結腸癌細胞的侵襲能力通過Transwell小室侵襲實驗分析經黃芩素處理48 h后腫瘤細胞的侵襲力變化(圖3)。結果顯示，相對于0 μmol/L黃芩素處理組，50、75 μmol/L黃芩素處理組細胞遷移數量分別下降18.32%(P＜0.05)、40.72%(P＜0.01)，差異具有統計學意義。

圖3 黃芩素對SW620細胞侵襲能力的影響

2.3 黃芩素對PTEN、Akt及p-Akt蛋白表達的影響與0 μmol/L黃芩素處理組相比較，50、75 μmol/L黃芩素處理組PTEN蛋白表達明顯高于對照組，p-Akt低于對照組(P＜0.05，圖4)。

圖4 黃芩素對SW620細胞PTEN、Akt及p-Akt表達的影響

3 討論

來源于傳統中藥的黃酮類化合物黃芩素在多種腫瘤細胞中顯示出明顯的抗腫瘤活性。黃芩素能通過表皮生長因子受體通路抑制子宮頸癌細胞的增生[11]，通過降低12-LOX mRNA的途徑抑制肝癌細胞的增生并誘導細胞的凋亡[12]，食管癌細胞體外研究中，黃芩素還可作用于PI3K/Akt信號通路進一步影響腫瘤細胞的增生與凋亡[13]。除影響腫瘤細胞的增生與凋亡外，黃芩素還能夠通過影響人胰腺癌腫瘤細胞偽足形成，導致細胞的侵襲力下降[14]，通過降低MMP-2、整合素α2表達，抑制MG63細胞的侵襲轉移能力[15]。

前期研究表明[16]，黃芩素能夠顯著抑制結腸癌細胞的增生與凋亡，改變凋亡相關基因的表達。本研究通過EdU及MTT實驗進一步驗證了黃芩素對結腸癌SW620細胞生長的影響。EdU結果表明，較高濃度的黃芩素(50、75 μmol/L)能夠顯著抑制人結腸癌細胞的DNA復制活性，細胞生長受到影響。MTT結果顯示，經黃芩素處理后，腫瘤細胞增生受到抑制，而且和藥物劑量及作用時間呈正相關。侵襲及轉移能力是惡性腫瘤的重要特征，Transwell小室實驗結果表明，黃芩素能夠降低結腸癌細胞的侵襲能力。

PTEN是一種人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因，通過p53信號傳導通路發揮作用[17-18]。PTEN能夠使磷脂酰肌醇磷酸酯類3位脫磷酸，其主要作用底物為PIP3，后者可以介導Akt的磷酸化使后者發生活化，其中，p-Akt(ser473)是其主要的活化形式之一。PTEN可以將PIP3脫磷酸為PIP2，抑制Akt的激活，下調PI3K/Akt傳導通路，在細胞周期、細胞生長與分化的調控過程中起著重要的作用[19-20]。研究表明，在多種腫瘤的發生中，均存在PTEN基因的表達異常，多種mir-RNA均可通過PTEN/Akt途徑影響細胞的增生、侵襲與凋亡[21-24]。本研究WB結果顯示，黃芩素能夠增加SW620細胞中PTEN蛋白的表達，降低Akt的活化(p-Akt ser473)，影響PTEN/Akt調節通路，提示黃芩素對結腸癌腫瘤細胞的影響可能是通過PTEN/Akt途徑來實現的。

綜上所述，本研究進一步揭示了結腸癌細胞中黃芩素所表現出的抗腫瘤活性及其可能機制，為其臨床輔助抗腫瘤應用提供了理論支持，但PTEN/Akt途徑是否為最主要的抗腫瘤機制以及其發揮抗腫瘤活性是否存在其他的作用機制尚需進一步的研究。

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