TNF-α對類風濕性關節炎患者滑膜成纖維細胞RUNX3表達的影響及意義

王春亮，王林，潘繼紅

(濟南大學 山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，濟南250062)

滑膜成纖維樣細胞是類風濕性關節炎的主要效應細胞。類風濕性關節炎患者成纖維細胞增殖能力升高、凋亡能力降低[1,2]。TNF-α可促進破骨細胞的活化與骨吸收，并誘導其他炎性因子、黏附分子以及骨與軟骨相關蛋白酶表達，從而引起滑膜襯里層增厚、骨及關節軟骨破壞，進一步加劇關節炎癥反應[1]。Runt相關轉錄因子3(RUNX3)屬于Runt相關轉錄因子家族，包括RUNX1、RUNX2、RUNX3三個家族成員，均擁有高度保守的RD(runt domain)結構域。研究認為，RUNX3與潰瘍性結腸炎密切相關[3]。全基因組關聯分析研究顯示，RUNX3的單核苷酸多態性遺傳易感位點與強直性脊柱炎、銀屑病、銀屑病性關節炎、乳糜瀉、過敏性皮膚炎、克羅恩氏病、哮喘等疾病有關[4]。但其在類風濕性關節炎發病中的作用卻鮮見報道。為此，我們于2016年10月～2017年11月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 ①關節滑膜組織：選擇山東省醫學科學院學術合作單位山東省立醫院骨科收治的、擬行膝關節置換術的類風濕性關節炎患者39例(男16例、女23例，平均年齡60歲)，術中采集其滑膜組織標本39例份。本研究通過山東省醫學科學院倫理委員會審核，患者及家屬均知情同意。②主要試劑：Ⅱ型膠原酶(Solarbio，中國)；人源RUNX3基因腺病毒(Vigene，美國)，GFP對照腺病毒(Vigene，美國)，助感染試劑(Vigene，美國)；siRUNX3(銳博，中國)，Hiperfect轉染試劑(Qiagen，德國)；TRIzol Reagant(Invitrogen，美國)，SYBR(康為世紀，中國)，ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo，日本)。

1.2 成纖維細胞分離及原代培養 采用含1%雙抗的Hank′s平衡鹽溶液沖洗類風濕性關節炎滑膜組織5 次，將絨毛狀纖維組織用高壓滅菌剪刀剪下，置于無菌培養皿中充分剪碎。適當加入DMEM高糖培養基與Ⅱ型膠原酶(體積比為100∶4)混合液約3 mL，混勻后37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育6 h。加入3 mL 0.25%胰蛋白酶-無EDTA的消化液，反復吹打至勻漿；70 μm細胞篩網過濾，1 500 r/min離心5 min。棄上清，將下層細胞沉渣吹打均勻后接種于含10% FBS和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養基(以下稱完全培養基)中，待細胞貼壁80%左右時除去懸浮的細胞。根據細胞狀態進行換液和傳代，采用自然純化法和反復貼壁法純化細胞，取傳3～8代細胞用于后續實驗。

1.3 TNF-α對成纖維細胞RUNX3表達的影響 采用實時熒光定量PCR法。取傳3～8代的成纖維細胞，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-無EDTA的消化液消化5 min，離心去上清，完全培養基重懸細胞。將細胞接種至24孔板，調整細胞密度為(3～5)×104/孔。待細胞貼壁后，移棄培養基，加入TNF-α，調整其終濃度為0、0.1、1、10、50 ng/mL。分別于作用0、3、6、12、24 h，采用TRIzol法提取細胞總RNA，ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉錄合成cDNA。采用實時熒光定量PCR法檢測不同濃度TNF-α作用后細胞RUNX3相對表達量，嚴格按照試劑盒說明書操作。RUNX3上游引物：5′-TGTTCTGGATGCTCTTGTGC-3′，下游引物：5′-GCACTGAAAGAGGACATGAGC-3′；內參GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR反應體系10 μL；SYBER Green(熒光染料)5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，雙蒸水2 μL，cDNA 1 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共45個循環。采用2-ΔΔCt法計算RUNX3 mRNA相對表達量。

1.4 TNF-α對過表達RUNX3的成纖維細胞炎性因子表達影響的觀察

1.4.1 細胞分組處理 取傳3～8代成纖維細胞接種于24孔板，調整細胞密度為(3～5)×104/孔，將細胞隨機分為RUNX3過表達組和對照組。RUNX3過表達組和NC對照組分別感染人源RUNX3腺病毒、綠色熒光蛋白(GFP)對照腺病毒，MOI=50，濃度均為1.0×1010pfu/mL。加入1 μL助轉染試劑及稀釋10倍的腺病毒原液2.5 μL，調整終體積為500 μL。兩組作用12 h左右更換新鮮培養液繼續培養，作用24 h兩組均加入50 ng/mL TNF-α再刺激24 h。

1.4.2 炎性因子表達檢測 取1.4.1中TNF-α作用24 h的兩組細胞，采用實時熒光定量PCR法(參照1.3的方法)檢測兩組IL-6、前列腺素E2(PGE-2)、趨化因子CXC基序配體9(CXCL-9)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)及基質金屬蛋白酶13(MMP-13)表達。IL-6上游引物：5′-TGTAGCATGGGCACCTC-3′，下游引物：5′-CAGTGGACAGGTTTCTGAC-3′；PGE-2上游引物：5′-TGCGTTCAGTCCTCTGT-3′，下游引物：5′-CAGGAAGTTTGTGTTGCATC-3′；CXCL-9上游引物：5′-ATCTCTCCAACCAGATTGTCA-3′，下游引物：5′-TATTAGGCACTGTGGAAGAAAC-3′；MMP-2上游引物：5′-GTGCCTATTACCTGAAGCTG-3′，下游引物：5′-ATTTGATGCTTCCAAACTTCAC-3′；MMP-13上游引物：5′-AATATGTAGTATCTATATGACTATGCGT-3′，下游引物：5′-TTACTCTAACATTCTTCAATGTGGTTC-3′。

1.4.3 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。Transwell小室置于24孔板中，將成纖維細胞按(3～5)×104/孔接種于小室中，參照1.4.1的方法進行分組處理。下室加入500 μL DMEM培養基(10%血清+1%青鏈霉素雙抗)，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h，上下室均換成DMEM培養基(無血清+1%雙抗)對細胞進行饑餓處理，置于細胞培養箱6～8 h，將下室換成DMEM培養基(20%血清+1%雙抗)，置于細胞培養箱中培養24 h。培養結束后用預冷的PBS清洗3次，浸泡于4%多聚甲醛中4 ℃固定過夜，室溫下用瑞氏-吉姆薩染液染色6 h，預冷的PBS清洗2次。用一次性棉棒輕輕擦除小室上方細胞，鏡下觀察穿膜細胞數。

1.5 TNF-α對低表達RUNX3的成纖維細胞炎性因子表達的影響

1.5.1 細胞分組處理 取傳3～8代成纖維細胞接種于24孔板，調整細胞密度為(3～5)×104/孔，將細胞隨機分為RUNX3沉默組和對照組。RUNX3沉默組將5 μL siRUNX3和4 μL Hiperfect轉染試劑加入到100 μL DMEM無血清無抗高糖培養基中，混合靜置10 min后吸取100 μL轉移至24孔板中，調整終體積為500 μL，siRUNX3終濃度為200 nmol/L。對照組采用同樣的方法加入5 μL NC-control siRNA。作用24 h兩組均加入50 ng/mL TNF-α再刺激24 h。

1.5.2 炎性因子表達檢測 參照1.4.2的方法采用實時熒光定量PCR法檢測RUNX3沉默組和對照組IL-6、PGE-2、CXCL-9、MMP-2及MMP-13表達。

2 結果

2.1 經不同濃度TNF-α作用后成纖維細胞RUNX3表達比較 成纖維細胞RUNX3 mRNA相對表達量隨著TNF-α濃度升高及作用時間延長而逐漸升高，呈濃度和時間依懶性，以TNF-α濃度50 ng/mL、作用時間24 h時RUNX3 mRNA相對表達量上調最為顯著(P均<0.05)。見表1。

表1 經不同濃度TNF-α作用后成纖維細胞RUNX3mRNA相對表達量變化

2.2 RUNX3過表達組和對照組細胞侵襲能力及細胞各炎性因子表達比較 RUNX3過表達組和對照組穿膜細胞數分別為(56±4)、(20±3)個，兩組比較P<0.01。兩組各炎癥因子mRNA相對表達量比較見表2。

表2 兩組各炎性因子mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.3 RUNX3沉默組和對照組各炎性因子表達比較 見表3。

3 討論

研究認為，成纖維細胞在類風濕性關節炎發病的各個階段均具有重要作用。類風濕性關節炎發病過程中一旦成纖維細胞被激活，將產生一系列炎性因子及細胞外基質降解酶等介導炎癥反應，引起骨與軟骨的進行性破壞[5，6]。TNF-α為重要的炎性因子，可促進成纖維細胞活化與增殖，從而參與類風濕性關節炎的病變過程。RUNX3家族成員有RUNX1、RUNX2及RUNX3，三者高度同源，其部分功能可能是重疊的，既往研究通過全基因組關聯研究分析確定RUNX1是類風濕性關節炎的風險基因之一[7]；RUNX3與銀屑病、銀屑病性關節炎及強直性脊柱炎等自身免疫疾病相關[8]。本研究推測RUNX3可能也作為類風濕性關節炎的一個風險基因參與類風濕性關節炎病變過程。本研究結果顯示，成纖維細胞RUNX3 mRNA相對表達量隨著TNF-α濃度的升高及作用時間的延長而逐漸升高，呈濃度和時間依懶性，以TNF-α濃度50 ng/mL、作用時間24 h時成纖維細胞中RUNX3 mRNA相對表達量上調最為顯著。提示隨著病變關節處TNF-α等炎性因子的逐步積累，RUNX3表達也隨之上調，高表達的RUNX3可能是炎性因子介導的長期慢性類風濕性關節炎的一個必要條件。

表3 兩組各炎性因子相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

MMP-13屬于基質金屬蛋白酶家族成員中的膠原酶亞型[9,10]，對Ⅱ型膠原的降解作用最強，從而使膠原網狀結構受到破壞，導致原本被細胞外基質包埋的軟骨細胞暴露于炎性因子的攻擊之下，并與細胞侵襲能力密切相關。MMP-13啟動子區存在RUNX3結合位點[11]，因此我們認為成纖維細胞中RUNX3可能通過結合MMP-13啟動子區而調控其表達。本研究結果顯示，RUNX3過表達組穿膜細胞數明顯多于NC對照組，說明上調RUNX3表達可促進成纖維細胞侵襲。IL-6參與成纖維細胞信號轉導，可促進炎癥相關細胞及破骨細胞分化，并將其募集到相關關節處[12～14]。本研究結果顯示，上調成纖維細胞RUNX3后加入TNF-α刺激可顯著上調IL-6、PGE-2、MMP-13表達，而沉默RUNX3后加入TNF-α刺激可顯著下調IL-6、MMP2、CXCL-9和MMP-13表達。RUNX3調控共同的炎性因子為IL-6和MMP-13；推測IL-6可能是RUNX3除MMP-13之外的另一個下游靶分子，RUNX3可通過直接上調IL-6表達促進關節炎癥反應，從而推動類風濕性關節炎進展。本研究RUNX3過表達組和對照組CXCL-9、MMP-2 mRNA相對表達量比較差異無統計學意義，RUNX3沉默組和對照組PGE-2 mRNA相對表達量比較無統計學差異。因此推測，RUNX3對成纖維細胞細胞侵襲能力的影響可能與PGE-2、CXCL-9、MMP-2無關。

綜上所述，TNF-α可促進成纖維細胞中RUNX3表達，并呈濃度和時間依懶性；RUNX3表達升高可促進成纖維細胞的細胞侵襲能力，其機制可能與調控MMP-13、IL-6表達有關。

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