下肢動脈硬化閉塞癥患者PECAM-1基因多態性與支架植入術后再狹窄的關系

左江偉，郭思恩，王斌強，韋涌初

(1廣西醫科大學第三附屬醫院 南寧市第二人民醫院，南寧530031；2廣西醫科大學第一附屬醫院)

下肢動脈硬化閉塞癥(AOD)的病理基礎是動脈壁粥樣硬化[1]。球囊擴張和支架植入是目前臨床上治療AOD的常用方法，能夠迅速疏通閉塞血管，但術后再狹窄發生率較高[2,3]。血小板內皮細胞黏附分子1(PECAM-1)是成熟血管內皮細胞特異性表達的分子之一，可作為血管內皮細胞標志物[4]。近年研究發現，PECAM-1基因多態性與動脈粥樣硬化關系密切。PECAM-1基因第3外顯子LeuI25Val和第8外顯子Asn563Ser已被證實與細胞黏附及跨內皮遷移有關[5,6]。本研究探討AOD 患者PECAM-1 LeuI25Val和Asn563Ser基因多態性與支架植入術后再狹窄的關系。

1 臨床資料

1.1 基本資料 選擇2013年6月～2014年12月廣西醫科大學第三附屬醫院和廣西醫科大學第一附屬醫院收治的AOD患者233例，均行球囊擴張+支架植入治療。其中，男139例、女94例，年齡45～85(66.4±7.6)歲，FontaineⅠ期51例、Ⅱ期55例、Ⅲ期65例、Ⅳ期62例，合并高血壓49例、冠心病114例、高脂血癥68例、糖尿病37例。納入標準：①既往病史、臨床查體、影像學檢查等臨床病理資料齊全；②隨訪時間為3年；③保留血液樣本。排除標準：①血液系統疾病；②免疫系統疾病；③良惡性腫瘤；④術后1月內發生閉塞；⑤未能按約定完成隨訪或隨訪期間死亡。其中術后3年出現再狹窄者93例作為觀察組，術后3年未出現再狹窄者140例作為對照組。觀察組男56例、女37例，年齡(66.8±8.2)歲，FontaineⅠ期14例、Ⅱ期18例、Ⅲ期28例、Ⅳ期33例，合并高血壓25例、冠心病60例、高脂血癥38例、糖尿病22例；對照組男83例、女57例，年齡(66.3±7.5)歲，FontaineⅠ期37例、Ⅱ期37例、Ⅲ期37例、Ⅳ期29例，合并高血壓24例、冠心病54例、高脂血癥30例、糖尿病15例。觀察組BMI、Fontaine Ⅳ期構成比以及合并冠心病、高脂血癥和糖尿病構成比均高于對照組(P均<0.05)，其余資料比較P均>0.05。

1.2 血漿PECAM-1水平 兩組均于入院檢查時采集外周靜脈血，EDTA抗凝，- 80 ℃超低溫冰箱保存。冰上解凍后，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，分離血漿，采用ELISA法檢測血漿PECAM-1，操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行。結果顯示，觀察組與對照組血漿PECAM-1水平分別為(73.6±18.4)、(93.5±22.4)ng/mL，兩組比較P<0.01。

1.3 PECAM-1基因多態性檢測 ①DNA提取：采用DNA提取試劑盒(TAKARA)抽提血液樣本的DNA，操作步驟主要包含菌體裂解、DNA與膜結合、DNA純化等，均嚴格按照說明進行，所得DNA經瓊脂糖凝膠電泳定量。② Leu125Val(373C/G)與Asn563Ser(1688T/C)提取：通過聚合酶鏈反應-限制性片斷多態性(PCR-RFLP)技術提取PECAM-1基因的Leu125Val(373C/G)與Asn563Ser(1688T/C)，引物由TAKARA設計與完成。Leu125Val(373C/G)上游引物：5′-GCTCCATCTGCTTGCCTGT-3′，下游引物：5′-TCTCAGCACCACCTCTCACG-3′。Asn563Ser(1688T/C)上游引物：5′-TGGAGACCCTGACTCACCTC-3′，下游引物：5′-TGCAATGTGCTGTGAATGAA-3′。③酶切與鑒定：采用限制性內切酶酶切所得基因后再次進行瓊脂糖凝膠電泳，Leu125Val(373C/G)的變異產物被切為188 bp和37 bp兩個片段，野生純合子CC為225 bp，雜合子CG為225 bp+188 bp+37 bp，突變純合子GG為188 bp+37 bp；Asn563Ser(1688T/C)的變異產物被切為217 bp和121 bp兩個片段，野生純合子TT為338 bp，雜合子TC為338 bp+217 bp+121 bp，突變純合子CC為217 bp+121 bp。結果顯示，觀察組Leu125Val基因G基因型和突變純合子GG頻率高于對照組，C基因型和野生純合子CC頻率低于對照組；Asn563Ser基因C基因型和突變純合子CC頻率高于對照組，T基因型和野生純合子TT頻率低于對照組；組間比較P均<0.05。見表1。

表1 兩組PECAM-1 Leu125Val與Asn563Ser位點等位基因和基因型頻率比較[例(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05。

1.4 AOD術后3年再狹窄的危險因素分析 將BMI、Fontaine分期、冠心病、高脂血癥、糖尿病、血漿PECAM-1水平、PECAM-1 Leu125Val與Asn563Ser基因多態性一并納入Logistic回歸分析。結果顯示，Fontaine分期Ⅲ、Ⅳ期及冠心病、高脂血癥、糖尿病、血漿PECAM-1水平<88.4 ng/mL、PECAM-1 Leu125Val GG突變和Asn563Ser CC突變均為AOD術后3年再狹窄的危險因素(P均<0.05)。見表2。

表2 AOD術后再狹窄的危險因素的Logistic回歸分析結果

2 討論

目前臨床治療AOD主要借助于動脈重建或介入療法恢復血管暢通。術后動脈再狹窄是影響患者預后的主要原因[7,8]。多數AOD患者發生再狹窄可能與下肢承受了人體主要重量有關。根據術后再狹窄的發生時間，將術后閉塞分為早期(術后1個月內)閉塞和中晚期閉塞，早期閉塞多為手術技巧問題或抗血小板藥物使用不當，中晚期閉塞的主要原因是栓子形成和內膜增生，主要受兩個因素影響：一是動脈粥樣硬化，不穩定斑塊脫落形成栓子和血管內膜增生；二是手術和支架對血管內皮的刺激[9,10]。球囊擴張過程本身會對血管內皮細胞造成損傷，另外血流自宿主動脈流經支架時順應性的改變可能產生一定程度的機械應力，從而刺激吻合口血管內膜增生。

PECAM-1是一種細胞表面糖蛋白，屬于細胞黏附分子免疫球蛋白超家族成員，高表達于血小板、血管內皮細胞及部分免疫細胞，主要介導內皮細胞之間、內皮細胞與其他細胞之間的黏附作用[11,12]。有研究已證實，動脈粥樣硬化患者血漿PECAM-1水平偏低[13]。本研究發現AOD術后3年再狹窄患者血漿PECAM-1水平亦明顯偏低。炎癥細胞聚集并黏附于血管內皮細胞是動脈粥樣硬化發生與發展的重要始動環節，該作用主要是通過細胞黏附分子來完成的，介導這一過程的細胞黏附分子有四類，各類黏附分子的功能不盡相同[14]。其中PECAM-1又稱為CD31，幾乎表達于成熟個體的所有血管內皮細胞，既是構成細胞膜的重要成分，也是連接內皮細胞組成成分，可直接參與血管床的構成[15]。因此，PECAM-1水平降低可能造成內皮細胞損傷，破環血管床的穩定性，誘發形成栓子及血管內膜增生。

PECAM-1基因多態性已被證實與動脈粥樣硬化腦梗死和靜脈血栓形成有關[16,17]，其是否關系到AOD血管支架植入術后再狹窄國內鮮見報道。目前，PECAM-1基因已發現11個單核苷酸多態性，其中3個被證實參與AOD的病理過程，包括Leu125Val(373C/G)、Asn563Ser(1688T/C)和Gly670Arg(2008G/A)。Leu125Val(373C/G)和Asn563Ser(1688T/C)可介導細胞間黏附作用及細胞跨內皮遷移，Gly670Arg(2008G/A)主要介導細胞內信號轉導。本研究主要考察前兩個位點的基因多態性。本研究結果顯示，觀察組Leu125Val基因G基因型和突變純合子GG頻率高于對照組，Asn563Ser基因C基因型和突變純合子CC頻率高于對照組，這與國內學者對動脈粥樣硬化腦梗死的研究結果一致[18]。可能是由于腦梗死和AOD支架植入術后再狹窄具有相似的病理機制，即血栓形成和血管內膜增生。考慮到BMI、Fontaine分期、冠心病、高脂血癥、糖尿病、血漿PECAM-1水平等也是AOD支架植入術后再狹窄的影響因素，本研究將各因素均納入Logistic回歸分析，發現Fontaine分期Ⅳ期、冠心病、高脂血癥、糖尿病、血漿PECAM-1水平<88.4 ng/mL、PECAM-1 Leu125Val GG突變和Asn563Ser CC突變均為AOD術后3年再狹窄的獨立危險因素。該結果說明排除各個因素間的相互影響與作用，Leu125Val GG突變和Asn563Ser CC突變仍能夠增加AOD術后再狹窄的風險。

綜上所述，PECAM-1 Leu125Val GG突變和Asn563Ser CC突變與AOD支架植入術后再狹窄有關。

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