尖銳濕疣皮損組織HBD-2、HBD-3、Bcl-2表達變化及意義

歐偉洪，陳曉東

(中南大學湘雅醫院附屬海口醫院，海口570208)

尖銳濕疣是由人乳頭瘤病毒(HPV)感染所致的性傳播疾病，其發生、發展的具體機制尚未完全闡明[1,2]。尖銳濕疣好發于肛門及外陰，初期可出現淡紅色丘疹，并逐漸轉化為菜花樣、乳頭瘤樣等贅生物，持續進展可出現潰瘍、繼發感染等。防御素是一類可殺死細菌、真菌或者病毒等微生物并有抗腫瘤活性的多肽。人β防御素2(HBD-2)、HBD-3作為抗菌肽，能夠與機體發生間接或直接的免疫防御反應，抑制并殺滅病原菌，其過度表達與多種皮膚病的發生有關[3～5]。B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)基因能夠調控腫瘤相關胞嘧啶及移植抗原啟動子序列，并于活化增殖細胞中大量轉錄，其高度表達能夠影響抗癌藥物活性[6]。本研究探討尖銳濕疣皮損組織HBD-2、HBD-3、Bcl-2表達變化及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年3月～2017年3月中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院收治的尖銳濕疣患者165例(觀察組)，男85例、女80例，年齡20～60(33.41±7.65)歲，病程0.5～4(1.53±0.74)個月；均給予皮損部位液氮冷凍治療，將全部疣體皮損清除，并外用康復新液，持續使用1個月。入選標準：符合尖銳濕疣診斷標準[7]，外陰均有明顯的皮損；入組前均未接受免疫抑制劑、糖皮質激素等治療。排除標準：艾滋病及梅毒血清學檢查提示陽性；肝腎功能損傷；結核病、銀屑病史；妊娠及哺乳期婦女。選擇同期收治的165例皮膚健康志愿者為對照組，均無皮膚病變史，年齡21～58(31.93±7.94)歲，其中男81例，均進行包皮環切術；女84例，均進行性器官美容整形手術。兩組年齡、性別具有可比性。

1.2 皮損組織HBD-2、HBD-3、Bcl-2表達檢測 采用免疫組織化學法。觀察組分別于治療前及治療結束時收集皮損組織標本，女性主要選擇陰道及大小陰唇等部位疣體組織，男性主要選擇肛周及陰莖等部位疣體組織。對照組男性標本為包皮環切術后的正常包皮，女性標本為性器官美容整形患者的健康外陰組織。將標本制作為蠟塊并切片，脫蠟至水。室溫下以3%過氧化氫浸泡15 min，采用蒸餾水沖洗，并以磷酸鹽緩沖液浸泡3次；將切片進行熱抗原修復，反復沖洗3次，滴加5% BSA封閉，室溫下孵育20 min；加入HBD-2、HBD-3、Bcl-2一抗工作液(濃度均為1∶300)，于4 ℃冰箱過夜；次日取出標本，于室溫下放置30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，加入生物素化二抗工作液，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3次，加入鏈霉親和素復合體，37 ℃孵育20 min；PBS沖洗3次，加入3,3-二氨基聯苯胺并避光顯色，于顯微鏡下查看染色情況，并控制反應時間，及時終止反應；自來水沖洗后，復染、脫水、透明并封片。在光學顯微鏡下觀察，選擇MIAS2000圖像分析系統，統計HBD-2、HBD-3陽性區域平均光密度(MOD)值及Bcl-2表達陽性率。HBD-2陽性判定標準：以鏡下細胞質出現棕黃色顆粒為陽性；HBD-3陽性判定標準：以鏡下細胞質出現紅色顆粒為陽性。Bcl-2定位于細胞質內，以出現棕褐色至淡黃色顆粒樣物質為陽性。

2 結果

2.1 兩組皮損組織HBD-2、HBD-3、Bcl-2表達比較 見表1。

表1 兩組皮損組織HBD-2、HBD-3、Bcl-2表達比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與同組治療前比較，#P<0.01。

2.2 尖銳濕疣患者皮損組織HBD-2、HBD-3表達和Bcl-2表達的相關性 尖銳濕疣患者皮損組織HBD-2、HBD-3表達與Bcl-2表達均呈正相關(r分別為0.709、0.680，P均<0.05)，HBD-2與HBD-3表達呈正相關(r=0.671，P<0.05)。

3 討論

尖銳濕疣好發于性活躍階段，宿主免疫缺陷時易誘發HPV感染，但大部分免疫正常者宿主感染HPV后可痊愈，說明可通過增加免疫應答反應以抵抗HPV感染[11]。

抗菌肽為天然黏膜及表皮免疫的主要成分，具有抗腫瘤、抗真菌、抗病毒等生物活性。HBD-2及HBD-3能夠參與抗菌肽的形成，屬于β防御素，能夠在多種細胞因子誘導下生成，主要于角質形成細胞及上皮細胞中表達，共同調控機體天然免疫系統[12]。研究發現，銀屑病角質形成細胞中HBD-2及HBD-3表達明顯升高，皮膚、口腔黏膜等組織中均有二者的表達[13]；尖銳濕疣患者皮損組織HBD-2及HBD-3表達明顯高于正常皮膚組織[14]。本研究結果顯示，觀察組治療前皮損組織HBD-2及HBD-3表達升高，且治療后HBD-2及HBD-3表達低于治療前。說明局部HPV感染能夠刺激免疫反應，從而促進HBD-2及HBD-3表達；經治療HPV感染被控制，HBD-2及HBD-3表達降低。提示HBD-2及HBD-3可能參與了尖銳濕疣的發生，二者表達變化可反映疾病的轉歸。

Bcl-2為凋亡抑制基因，主要于細胞中線粒體核膜、外膜及粗面內質網上表達，其過度表達可抑制多種因素所致的細胞凋亡，促進細胞增殖。研究發現，在多種凋亡細胞中Bcl-2表達明顯下降[15]。邢春瑤等[16]報道，Bcl-2過表達能夠抑制細胞凋亡，其可通過特定通路調控皮損組織細胞凋亡，導致細胞凋亡與增殖失衡，引發疾病。本研究觀察組皮損組織中Bcl-2表達明顯高于對照組，提示Bcl-2高表達可抑制皮損組織細胞凋亡，促進該病的發生及進展；經治療Bcl-2表達明顯下調，可能與疾病經治療后細胞凋亡的異常調控得到糾正有關[17]。本研究進一步發現，尖銳濕疣患者HBD-2、HBD-3、Bcl-2三者兩兩表達均呈正相關，說明三者之間可能存在一定相互作用。推測機體感染HPV后能夠誘導HBD-2、HBD-3、Bcl-2大量表達，促進疾病發生、發展。

綜上所述，尖銳濕疣皮損組織HBD-2、HBD-3、Bcl-2表達均上調，三者表達變化參與尖銳濕疣的發生并可反映疾病轉歸。

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