過表達SOX6基因對卵巢癌SKOV3細胞增殖、凋亡的影響及其機制

劉恩令，周玉秀，王立群，李君，陳梅，張冬紅，蔡朝輝，陳俊臣

(河北醫科大學附屬唐山市工人醫院，河北唐山063000)

SOX6屬于SRY相關基因家族，該家族能夠編碼一系列轉錄因子，其共同特點是具有保守的HMG-box DNA結合域[1]。有研究表明，SOX6基因異常表達參與多種腫瘤的發生、發展[2,3]。但SOX6基因對卵巢癌細胞生物學特性的影響鮮見報道。2018年1月，本研究采用特異性質粒轉染卵巢癌SKOV3細胞，挑選穩定過表達SOX6基因的細胞，檢測該細胞增殖、凋亡情況，探討SOX6基因在卵巢癌發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌SKOV3細胞株購于美國ATCC公司。Edu增殖試劑盒、Hoechst33342試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自日本東仁公司，蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、PTEN及β-actin抗體均購自美國CST公司。酶標儀購自美國Thermo公司，熒光顯微鏡購自Becton Dickinson公司，INTERFERINGTM轉染試劑購自法國Polyplus Transfection公司，特異性overexpression序列及其陰性對照序列、重組質粒pcDNA3.1-SOX7及其陰性空載體pc-DNA3.1-mock購自上海生工科技公司，cDNA反轉錄酶試劑盒購自日本TaKaRa公司，RPMI 1640培養基購自Hyclone公司。

1.2 過表達SOX6基因的SKOV3細胞模型構建 SKOV3細胞培養于含10% FBS的RPMI 1640培養基中，每孔2×105個細胞。培養基中常規加入100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素，培養溫度為37 ℃。挑選生長良好的細胞隨機分為實驗組及對照組，每組3個復孔，分別轉染pcDNA3.1-SOX7及pc-DNA3.1-mock。轉染48 h后采用熒光定量PCR法檢測SOX6表達，結果顯示，實驗組及對照組SOX6 mRNA相對表達量分別為(353.3±27.3)%、(100.0±2.1)%，實驗組高于對照組(P<0.05)。提示過表達SOX6基因的SKOV3細胞模型構建成功。

1.3 過表達SOX6基因的SKOV3細胞相關指標觀察

1.3.1 細胞活性 將兩組細胞以1×104個/孔接種于96孔板，置于細胞培養箱中培養72 h。將100 μL新鮮培養基與10 μL CCK-8試劑混合并加入各孔。將96孔板置于37 ℃孵育1 h，采用酶標儀測定450 nm波長處的光密度(OD)值。

1.3.2 細胞增殖情況 采用Edu熒光染色法。取兩組對數生長期細胞，以4 000個/孔接種于96孔板中，培養至對數生長期。用細胞培養基按1 000∶1的比例稀釋 Edu 溶液(試劑A)，制備適量50 μmol/L的Edu培養基，每孔加入100 μL 50 μmol/L的Edu培養基孵育1 h，棄培養基，PBS清洗細胞 1～2次，每次5 min，每孔加入100 μL細胞固定液(含4%多聚甲醛的PBS)，室溫孵育30 min；每孔加入2 mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5 min，棄甘氨酸溶液，每孔加入100 μL PBS，脫色搖床清洗5 min，棄PBS，每孔加入100 μL滲透劑(含0.5%Triton X-100的PBS)，脫色搖床孵育 10 min，PBS清洗 1次，每孔加入100 μL 1 mg/mL DAPI，避光、室溫、脫色搖床孵育10 min，PBS 清洗1～3次。染色完成后，熒光顯微鏡(×100)下隨機取5個視野，計數總細胞數及Edu染色陽性細胞數，計算細胞增殖率。細胞增殖率=Edu染色陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.3.3 細胞凋亡情況 采用Hoechst法。將兩組細胞接種于事先放有載玻片的培養板中，在培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗，15～25 ℃條件下置于新配制的4%多聚甲醛中固定1 h。PBS洗3遍，將制備好的玻片浸泡在裝有Hoechst33342染液的染色缸中，避光作用10 min；熒光顯微鏡(×100)下選用340 nm的激發光觀察，活細胞呈彌散均勻熒光，凋亡細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。如果觀察到≥3個DNA熒光碎片判定為凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

1.3.4 PTEN、Akt及p-Akt蛋白表達 采用Western blotting法。將兩組細胞用RIPA裂解，提取細胞總蛋白，12% SDS-PAGE電泳后轉到聚偏氟乙烯膜上，室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入特異性PTEN、Akt、p-Akt、β-actin一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，室溫下孵育1 h，采用ECL化學發光和曝光顯影。其中一抗有效濃度為1∶1 000～1∶2 000。以β-actin為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參β-actin蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 兩組細胞活性比較 實驗組及對照組OD450值分別為2.1±0.1、4.3±0.5，組間比較P<0.05。

2.2 兩組細胞增殖率比較 實驗組及對照組細胞增殖率分別為(13.2±2.2)%、(43.3±4.2)%，組間比較P<0.05。

2.3 兩組細胞凋亡率比較 實驗組及對照組細胞凋亡率分別為(15.2±3.2)%、(5.2±1.4)%，組間比較P<0.05。

2.4 兩組PTEN、Akt及p-Akt蛋白表達比較 與對照組比較，實驗組PTEN蛋白表達增加，p-Akt蛋白表達降低，組間比較P均<0.05。見表1。

表1 兩組PTEN、Akt及p-Akt蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

SOX家族是一類高度保守的HMG結構域，其編碼的蛋白廣泛參與性別決定、調節胚胎神經系統發育、軟骨形成、血細胞生成、晶狀體發育等多臟器分化，在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用[4]。SOX6是SOX基因家族的一個重要成員。有研究表明，抑制SOX6基因表達能夠促使腦干細胞朝膠質瘤樣細胞分化[2]；SOX6參與多種腫瘤的發生、發展，在肝癌組織中SOX6表現為抑癌基因作用[3,5]。SOX6表達增加能顯著抑制食管癌細胞增殖[6]；能夠通過抑制胰腺癌細胞表皮間質化過程，同時感染Akt信號通路，從而降低細胞侵襲力[7]。與瘤旁正常組織相比，SOX6在骨肉瘤組織中低表達，通過下調TWIST1表達抑制腫瘤細胞的遷移、侵襲及表皮間質化過程[8]。SOX6還可抑制前列腺癌、直腸癌細胞增殖[9,10]。但是，SOX6與卵巢癌的關系目前尚未明確。本研究結果顯示，特異性重組質粒pcDNA3.1-SOX6可增加 SKOV3細胞SOX6基因表達，過表達SOX6的SKOV3細胞活性下降，細胞增殖率降低，細胞凋亡率升高。證實過表達SOX6可顯著抑制卵巢癌SKOV3細胞活性及其增殖，并可促進細胞凋亡。SOX6在卵巢癌中的作用與上述研究中的結果相一致。

研究證實，PTEN/Akt信號通路廣泛參與腫瘤細胞的增殖、分化、轉移等多個過程，在多數惡性腫瘤中，PTEN表達均被抑制，從而導致PI3K/Akt持續激活，如在乳腺癌中PTEN蛋白表達抑制導致Akt蛋白持續磷酸化，進而參與腫瘤的發生、發展[11～14]。PTEN/Akt通路激活可抑制卵巢癌細胞增殖[11]，而抑制該通路則促進卵巢癌細胞增殖[15]。本研究采用Western blotting法檢測PTEN/Akt信號通路的關鍵蛋白PTEN、Akt及p-Akt，首次證實在卵巢癌SKOV3細胞中過表達SOX6基因能夠顯著促進PTEN蛋白表達，Akt蛋白表達無變化，磷酸化的Akt蛋白表達降低，說明PTEN/Akt信號通路參與了SOX6基因過表達對SKOV3細胞增殖及凋亡影響的過程，而是否有其他信號通路參與該過程則有待更進一步研究。

綜上所述，過表達SOX6基因能夠抑制卵巢癌SKOV3細胞增殖并促進細胞凋亡，其機制可能與抑制PTEN/Akt細胞信號通路激活有關。

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