STAT3抑制劑WP1066對卵巢癌SKOV3細胞凋亡和侵襲的影響及其機制

張自輝，梅梅，鄧杰

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院，湖北襄陽441000)

卵巢癌易復(fù)發(fā)，且對化療藥物耐藥率高，患者預(yù)后差，其病死率居婦科癌癥的首位[1,2]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)是一類通過二聚體/異二聚體的形式將細胞外信號傳遞到細胞內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄因子[3,4]。其中STAT3對淋巴瘤、黑色素瘤、口腔鱗狀細胞癌等多種腫瘤細胞增殖、侵襲具有調(diào)控作用[5～7]，但其對卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的影響報道較少。2016年8月～2017年10月，本研究觀察了STAT3抑制劑WP1066對卵巢癌SKOV3細胞凋亡和侵襲能力的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌SKOV3細胞株由中國科學(xué)院細胞庫提供，WP1066購自美國Selleck Chemicals公司，兔抗人Survivin、c-Myc、BCL-2、MMP-2、MMP-9抗體購自美國Santa Cruz公司，注射用順鉑購自山東齊魯制藥有限公司，F(xiàn)BS購自浙江天杭生物科技有限公司，McCoy′s 5A液體培養(yǎng)基購自武漢博士德生物工程有限公司。MTT 試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒由武漢賽維爾生物科技有限公司提供。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組處理 SKOV3細胞用含10% FBS的McCoy′s 5A液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，當細胞融合80%左右時，0.25%胰酶溶液(含0.02% EDTA)消化并傳代。取對數(shù)生長期細胞隨機分為空白對照組、WP1066組、順鉑組、聯(lián)合組。空白對照組常規(guī)培養(yǎng)，WP1066組給予含終濃度5 μmol/L WP1066培養(yǎng)，順鉑組給予含終濃度5 μg/mL順鉑培養(yǎng)，聯(lián)合組給予含終濃度5 μmol/L WP1066和5 μg/mL順鉑培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h時，收集各組細胞，進行以下研究。

1.3 細胞凋亡率檢測 將各組細胞2 000 r/min離心4 min，棄上清，PBS重懸，每管加入Annexin V-FITC結(jié)合液120 μL、Annexin V-FITC 3 μL、PI染色液5 μL，室溫避光孵育15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。將各組細胞制成5×104個/mL單細胞懸液，取100 μL放入含有Matrigel的Transwell上室，下室加入含10% FBS的McCoy′s 5A液體培養(yǎng)基600 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，甲醛固定并結(jié)晶紫染色，200倍光鏡下隨機選取5個視野并拍照，計數(shù)每組微孔膜外層細胞數(shù)。

1.5 Survivin、c-Myc、BCL-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達檢測 采用Western blotting法。采用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定各組細胞蛋白含量，上樣Buffer并沸水浴4 min，然后行SDS-PAGE，5%脫脂奶粉封閉60 min，分別加入Survivin(1∶200稀釋)、c-Myc(1∶500稀釋)、BCL-2(1∶400稀釋)、MMP-2(1∶500稀釋)、MMP-9(1∶500稀釋)一抗4 ℃孵育12 h，HRP標記羊抗兔抗體(1∶800稀釋)孵育60 min，TBST洗膜3次，ECL顯影，計算各蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞凋亡率比較 空白對照組、WP1066組、順鉑組、聯(lián)合組細胞凋亡率分別為(4.87±0.38)%、(11.53±0.71)%、(10.07±0.67)%、(19.28±0.52)%。WP1066組、順鉑組、聯(lián)合組細胞凋亡率均較空白對照組升高，聯(lián)合組高于WP1066組、順鉑組，組間比較P均<0.05。

2.2 各組細胞侵襲能力比較 對照組、WP1066組、順鉑組、聯(lián)合用藥組細胞穿膜數(shù)分別為(84.3±12.7)、(54.7±10.4)、(48.7±14.2)、(22.1±10.9)個。WP1066組、順鉑組、聯(lián)合組細胞侵襲能力均較空白對照組降低，聯(lián)合組低于WP1066組、順鉑組，組間比較P均<0.05。

2.3 各組Survivin、c-Myc、BCL-2、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量比較 見表1。

表1 各組Survivin、c-Myc、BCL-2、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與WP1066組比較，▲P<0.05；與順鉑組比較，▼P<0.05。

3 討論

目前在臨床上卵巢癌的診治面臨幾大難題，包括早期診斷困難、復(fù)發(fā)率高及化療耐藥等[8,9]。尋找有效且毒性更小的化療藥物以及分子靶點是目前臨床研究的熱點。研究表明，JAK2/STAT3通路在維持卵巢癌腫瘤干細胞功能方面具有重要作用，與腫瘤的起源、進展和維持密切相關(guān)[10]。WP1066作為STAT3抑制劑，可顯著抑制STAT3磷酸化水平，在多種腫瘤中均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用。本研究對體外培養(yǎng)的卵巢癌細胞分別給予WP1066、順鉑或兩藥聯(lián)合處理，結(jié)果顯示W(wǎng)P1066可促進SKOV3細胞凋亡、抑制其侵襲，效果與順鉑相當，且兩藥聯(lián)合效果更好。

Survivin是凋亡家族抑制劑的成員，在抑制細胞凋亡和促進有絲分裂方面發(fā)揮重要作用[11]。Survivin在胎兒組織中廣泛表達，在人體發(fā)育過程中表達受限，大多數(shù)正常成年組織中Survivin表達極低，但其在各種腫瘤包括卵巢癌中高表達[12]。卵巢癌組織或細胞中Survivin高表達可促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，并參與化療藥物耐藥、腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[13～16]。CyclinD1是一種細胞周期調(diào)節(jié)因子，是G1期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與腫瘤細胞惡性增殖密切相關(guān)[17]。Myc編碼3種高度相關(guān)的核磷蛋白，即c-Myc、N-myc、L-Myc，其中c-Myc是具有原癌基因功能的堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈蛋白，參與細胞增殖、分化和凋亡。c-Myc是一種高效轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)節(jié)高達15%的基因表達，從而調(diào)控細胞周期進程、增殖、分化及凋亡等[18]。因此，在腫瘤細胞中抑制c-Myc蛋白表達及活性，有助于抑制惡性腫瘤細胞增殖，阻止疾病進展。BCL-2家族是調(diào)節(jié)腫瘤細胞程序性細胞死亡的重要蛋白，主要包括抗凋亡蛋白(BCL-2、BCL-XL和MCL-1等)以及促凋亡蛋白(BAX、Bak、Bid和Bad等)[19]。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間的不平衡是導(dǎo)致腫瘤細胞異常增殖的生物學(xué)特征。BCL-2主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中，通過影響Caspases活化或調(diào)節(jié)線粒體的膜通透性，干擾抑制線粒體凋亡因子釋放到細胞質(zhì)中，從而抑制細胞凋亡[20]。WP1066作用SKOV3細胞后可抑制BCL-2蛋白表達，從而表現(xiàn)出促進SKOV3細胞凋亡的作用。MMPs是一類依賴鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶，可水解包括層黏連蛋白、膠原蛋白、纖黏連蛋白、蛋白聚糖等多種細胞外基質(zhì)，在正常組織生長發(fā)育、組織重塑、炎癥反應(yīng)及創(chuàng)傷修復(fù)等生理病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。根據(jù)其作用底物不同，可分為膠原酶(MMP-1/8/13/18)、明膠酶(MMP-2和MMP-9)、基質(zhì)溶素(MMP-3/7/10/11/28/27)、彈性蛋白酶(MMP-12)、與MMP-2活化有關(guān)的前肽區(qū)域中膜型特異性MMP(MMP-14/15/16/17/24/25)以及其他MMP(MMP-19/20/21/22/23/28)六類[21]。研究表明，MMP-2參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展，其表達水平與卵巢癌的臨床分期和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與病理分級及年齡無明顯相關(guān)性[22]。此外，MMP-9與卵巢癌的分化程度、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[23]。卵巢癌患者MMP-2和MMP-9高表達提示其預(yù)后更差。本研究結(jié)果顯示，WP1066可抑制SKOV3細胞中Survivin、c-Myc、BCL-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達，抑制效果與順鉑相當，且兩藥聯(lián)合抑制作用更強。

綜上所述，STAT3抑制劑WP1066具有促進卵巢癌SKOV3細胞凋亡、抑制細胞侵襲的作用，其機制與抑制Survivin、c-Myc、BCL-2、MMP-2及MMP-9蛋白表達有關(guān)。

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