丹皮酚干預(yù)聯(lián)合靶向沉默腎上腺髓質(zhì)素對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響

孫晶，李巖，喬富浩

(新泰市中醫(yī)醫(yī)院，山東泰安271200)

丹皮酚是從毛茛科植物牡丹干燥根皮中提取的一種植物活性成分，屬于苯酚類物質(zhì)，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等多種藥理作用[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚還具有抗腫瘤作用，能抑制結(jié)直腸癌、胃癌、食管癌等多種腫瘤生長[2，3]。腎上腺髓質(zhì)素(AM)最初是從人嗜鉻細胞瘤組織中分離出來的一種具有擴血管和利尿活性的多肽，后來研究證實，其在多種腫瘤組織中過表達，并對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)，通過小干擾RNA(siRNA)技術(shù)靶向沉默AM能抑制腫瘤細胞增殖和凋亡[4]。但丹皮酚聯(lián)合AM沉默能否增強抗腫瘤效果目前尚不清楚。2017年1月～2018年4月，我們觀察了丹皮酚聯(lián)合AM沉默對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響?，F(xiàn)分析結(jié)果并報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌細胞BGC-823(以下稱BGC-823細胞)，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，液氮中低溫保存。丹皮酚注射液，規(guī)格5 mg/mL，寧波天真制藥有限公司。超凈工作臺，上海精密儀器儀表有限公司；Multiskan FC酶標儀、Attune NxT流式細胞儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；Transwell小室，美國Corning公司；AlphaImager2200凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Alpha公司；Western blotting SDS-PAGE膠，成都艾特姆生物科技有限公司；PVDF膜，美國Millipore公司。MTT，美國Sigma公司；AnnexinV-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒，上海炎彬化工科技有限公司；GIMSA染色液，華中海威(北京)基因科技有限公司。

1.2 細胞傳代培養(yǎng) 將液氮中凍存的BGC-823細胞取出后盡快復(fù)蘇，接種于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天更換1次培養(yǎng)基。當細胞融合80%以上時，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3比例傳代。取傳3代對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 靶向沉默AM的siRNA篩選 由吉瑪基因公司根據(jù)文獻[4]設(shè)計了3條靶向沉默AM的siRNA。siRNA-839：正義序列5′-GCCCAUGGUACAAGGAAUATT-3′，反義序列5′-UAUUCCUUGUACCAUGGGCTT-3′；siRNA-1008：正義序列5′-GCUUCGCUUCCUUAGCCUUTT-3′，反義序列5′-AAGGCUAAGGAAGCGAAGCTT-3′；siRNA-1135：正義序列5′-GCUCGCCCACAAACUG-AUUTT-3′，反義序列5′-AAUCAGUUUGUGGGCGAGC-TT-3′。采用Real-time PCR法和Western bloting法驗證3條siRNA靶向沉默AM的效率。經(jīng)驗證，160 μmol/L siRNA-839靶向沉默AM的效率最高，故選擇siRNA-839進行后續(xù)實驗。

1.4 丹皮酚聯(lián)合siRNA-839藥物相互作用及丹皮酚最佳濃度和作用時間篩選 取傳3代、對數(shù)生長期BGC-823細胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM培養(yǎng)液重懸，制成密度為1×106個/mL的細胞懸液。取細胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL。隨機將細胞分為0 mg/mL 丹皮酚組、7.81 mg/mL 丹皮酚組、15.63 mg/mL 丹皮酚組、31.25 mg/mL丹皮酚組、62.50 mg/mL丹皮酚組、125.00 mg/mL 丹皮酚組，每組設(shè)6個復(fù)孔；然后分別加入160 μmol/LsiRNA-839、7.81 mg/mL 丹皮酚+160 μmol/L siRNA-839、15.63 mg/mL 丹皮酚+160 μmol/L siRNA-839、31.25 mg/mL丹皮酚+160 μmol/L siRNA-839、62.50 mg/mL丹皮酚+160 μmol/L siRNA-839、125.00 mg/mL 丹皮酚+160 μmol/L siRNA-839，并置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組分別于培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL孵育4 h，再加入DMSO 200 μL，充分振蕩，使結(jié)晶充分溶解。酶標儀570 nm波長處檢測各孔的吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-實驗孔A570值/對照孔A570值)×100%[5]。實驗重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果見表1。采用兩藥相互作用指數(shù)(CDI)[6]評價不同濃度丹皮酚聯(lián)合siRNA-839對BGC-823細胞的藥物相互作用性質(zhì)。結(jié)果顯示，不同濃度丹皮酚聯(lián)合siRNA-839對BGC-823細胞增殖抑制率均表現(xiàn)為協(xié)同作用，以62.50 mg/mL丹皮酚聯(lián)合160 μmol/L siRNA-839作用48 h時協(xié)同作用最明顯(CDI=0.507)。故選擇62.50 mg/mL 丹皮酚聯(lián)合160 μmol/L siRNA-839作用48 h時進行后續(xù)實驗。

表1 各組細胞增殖抑制率比較

注：與0 mg/mL丹皮酚組培養(yǎng)同時間比較，*P<0.05；與7.81 mg/mL丹皮酚組培養(yǎng)同時間比較，#P<0.05；與15.63 mg/mL丹皮酚組培養(yǎng)同時間比較，△P<0.05；與31.25 mg/mL丹皮酚組培養(yǎng)同時間比較，▲P<0.05；與同組培養(yǎng)24 h比較，▽P<0.05。

1.5 丹皮酚干預(yù)聯(lián)合靶向沉默AM對BGC-823細胞生物學(xué)行為影響的觀察

1.5.1 細胞增殖能力 采用平板克隆增殖實驗。取傳3代、對數(shù)生長期BGC-823細胞100個，接種于6孔板(內(nèi)含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基)。隨機將細胞分為空白對照組、丹皮酚組、siRNA-839組、聯(lián)合組，每組設(shè)3個復(fù)孔?？瞻讓φ战M加入含10% FBS的DMED培養(yǎng)基1 800 μL和生理鹽水200 μL，丹皮酚組加入含10% FBS的DMED培養(yǎng)基1 875 μL和丹皮酚注射液125 μL，siRNA-839組加入含10% FBS的DMED培養(yǎng)基1 840 μL和160 μmol/L siRNA-839 160 μL，聯(lián)合組加入含10% FBS的DMED培養(yǎng)基1 715μL、丹皮酚注射液125 μL和160 μmol/L siRNA-839 160 μL。均置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至肉眼可見的細胞增殖克隆時終止培養(yǎng)。PBS清洗，加入甲醇5 mL固定15 min，棄固定液，加入GIMSA染色液染色10～20 min。流水沖洗后，置于超凈臺空氣干燥，于10倍顯微鏡下計數(shù)大于10個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5.2 細胞侵襲能力 采用Transwell侵襲實驗。取BD matrigel基質(zhì)膠4 ℃冰箱過夜，次日，將BD Matrigel基質(zhì)膠用不含血清的DMEM按1∶9比例稀釋，取50 μL均勻涂于Transwell小室上層，再加入100 μL不含血清的DMEM培養(yǎng)液，水化BD Matrigel基質(zhì)膠30 min；Transwell小室下層中加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液500 μL。取傳3代、對數(shù)生長期BGC-823細胞，用DMEM培養(yǎng)液重懸，制成密度為1×106個/mL的細胞懸液。按1.5.1中方法分組處理48 h，取1.0×105個細胞加入Transwell小室上室，然后將Transwell小室置于預(yù)冷的24孔板，37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽輕輕拭去小室上層細胞，4%多聚甲醛固定10～15 min，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察。隨機選取10個視野，Leica DC 300F正置顯微鏡進行觀察和拍照，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5.3 細胞遷移能力 采用細胞劃痕實驗。取傳3代、對數(shù)生長期BGC-823細胞，用DMEM培養(yǎng)液重懸，制成密度為1×106個/mL的細胞懸液。取細胞懸液接種于6孔板(內(nèi)含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基)，每孔2.5×105個細胞，按1.5.1中方法分組處理48 h，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當細胞融合達90%時，用10 μL移液器槍頭垂直過中心劃直線，吸棄舊培養(yǎng)基，用無血清的DMEM培養(yǎng)液清洗，去除劃下的細胞，重新加入無血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h，取出6孔板，拍照，測量細胞劃痕處間距。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5.4 細胞凋亡率 采用流式細胞術(shù)。取傳3代、對數(shù)生長期BGC-823細胞，用DMEM培養(yǎng)液重懸，制成密度為1×106個/mL的細胞懸液。取細胞懸液接種于6孔板(內(nèi)含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基)，每孔2.5×105個細胞。按1.5.1中方法分組處理48 h，置37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，收集細胞并置于EP管中，室溫下加入1×Binding Buffer 100 μL重懸，然后加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2 結(jié)果

各組細胞增殖、侵襲、遷移能力和凋亡率比較見表1。

表1 各組細胞增殖、侵襲、遷移能力和凋亡率比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與丹皮酚組比較，#P<0.05；與siRNA-839組比較，△P<0.05。

3 討論

丹皮酚是從毛茛科植物牡丹皮中提取物出來的一種單體成分，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等多種藥理作用[7]。近年研究還發(fā)現(xiàn)，丹皮酚在體外對人紅細胞白血病細胞K562、人乳腺癌基因細胞株T6-17、肝癌細BEL-7404等腫瘤細胞增殖具有抑制作用，具有抗腫瘤作用[8]。目前認為，丹皮酚的抗腫瘤作用機制可能與提高TNF-α、IL-2生成和降低Bcl-2/Bax有關(guān)[9，10]。AM是從嗜鉻細胞瘤組織分離的、含有52個氨基酸的多肽類物質(zhì)，具有舒張血管、降低血壓，擴張支氣管平滑肌，促進胃酸分泌等生物學(xué)作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，AM還是腫瘤細胞的生長因子，在促進腫瘤細胞增殖和腫瘤血管生成等文獻具有重要作用；腫瘤細胞內(nèi)低氧環(huán)境可誘導(dǎo)AM表達升高，激活VEGF和HIF-1等相關(guān)信號通路,繼而促進腫瘤生長[11～14]；還可通過調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞內(nèi)cAMP和Ca2+濃度來刺激原癌基因表達，腫瘤細胞自體合成AM受體及其配體，以AM受體/配體自分泌的形式調(diào)節(jié)腫瘤生長[15，16]。采用siRNA技術(shù)靶向沉默AM可抑制調(diào)控腫瘤細胞生長的相關(guān)通路被激活，從而制腫瘤生長。本研究設(shè)計的siRNA-839即是針對腫瘤細胞中AM的靶向沉默基因，其可從分子信號通路上精準地降低AM表達，繼而抑制AM對腫瘤生長的刺激作用，延緩甚至阻斷腫瘤進展。

本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合應(yīng)用丹皮酚和siRNA-839對BGC-823細胞增殖的抑制具有協(xié)同作用，且62.50 mg/mL丹皮酚聯(lián)合160 μmol/L siRNA-839作用48 h時的協(xié)同作用效果最明顯。本研究進一步觀察了二者聯(lián)用對BGC-823細胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組克隆形成率、穿膜細胞數(shù)均明顯低于丹皮酚組和siRNA-839組，劃痕間距、細胞凋亡率均明顯高于丹皮酚組和siRNA-839組，且丹皮酚組與siRNA-839組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。說明丹皮酚與siRNA-AM在合適劑量下聯(lián)用具有明顯的協(xié)同抗腫瘤作用。

綜上所述，丹皮酚與siRNA-839聯(lián)用可協(xié)同抑制胃癌細胞的增殖、侵襲、遷移能力并促進其凋亡；丹皮酚的最佳濃度為62.50 mg/mL，siRNA-839的最佳濃度為160 μmol/L。本研究為丹皮酚與基因靶向藥物聯(lián)合應(yīng)用治療胃癌提供了重要依據(jù)。

參考文獻：

[1] 耿帥，趙育林，曾凱，等.丹皮酚的研究進展[J].中國新藥與臨床雜志，2016，35(5)：310-313.

[2] 高立民，滿其倩.丹皮酚抗腫瘤作用及作用機制研究進展[J].藥物評價研究，2016，39(2)：296-299.

[3] 李倩男，王琳琳，湯劍明，等.丹皮酚通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制人卵巢癌A2780細胞增殖的實驗研究[J].中華實用診斷與治療雜志，2017，31(11)：1062-1066.

[4] 李曼紅,曾慶純.腎上腺髓質(zhì)素與微血管密度在子宮頸癌中的表達意義研究[J].中國實用醫(yī)藥，2015，10(12)：58-59.

[5] 李秉樞，付瓊，程艷香，等.丹皮酚協(xié)同順鉑抗人宮頸鱗癌SiHa細胞及其機制[J].腫瘤學(xué)雜志，2010，16(11)：845-848.

[6] 張萌，邊志剛，何平.葫蘆素B對人胃癌BGC-823細胞增殖及凋亡的影響[J].實用藥物與臨床，2016，19(5)：548-552.

[7] 戴凌，田小林，譚寧，等.EMMPRIN基因增強CT26小鼠結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能[J].中國癌癥雜志，2010，20(9)：652-657.

[8] Xu Y,Zhu JY,Lei ZM,et al. Anti-proliferative effects of paeonol on human prostate cancer cell lines DU145 and PC-3[J]. J Physiol Biochem,2017,73(2):157-165.

[9] 劉同亭.徐長卿抗腫瘤分子生物學(xué)機制的研究進展[J].實用醫(yī)藥雜志，2016，33(5)：455-458.

[10] 相萍萍，許楠，陸澄.丹皮酚對甲狀腺未分化癌FRO細胞相關(guān)lncRNA表達的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2015，43(5)：27-30.

[11] Cai J,Chen S,Zhang W,et al. Paeonol reverses paclitaxel resistance in human breast cancer cells by regulating the expression of transgelin 2[J]. Phytomedicine,2014,21(7):984-991.

[12] 曾凡清，張蕾，馬明艾，等.丹皮酚對人卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響及其可能的機制[J].中國生物制品學(xué)雜志，2013，26(10)：1454-1457.

[13] 李巖，王平，丁曉彥，等.不同產(chǎn)地丹參脂溶性成分對H9C2心肌細胞缺氧缺糖損傷保護作用的差異[J].山東科學(xué)，2015，28(2)：18-25.

[14] 屈振，徐明，盧明柱，等.腎上腺髓質(zhì)素在肝癌組織中的表達及其與腫瘤組織微血管密度的關(guān)系[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2014，23(5)：489-490.

[15] 喬娜，王東彬，李中華，等.腎上腺髓質(zhì)素和其受體在腎細胞癌組織中的表達和意義[J].山東醫(yī)藥，2012，52(15)：72-73.

[16] 李云濤，崔娜，陳麗芬，等.乳腺癌中腎上腺髓質(zhì)素的表達及其與癌組織分化、轉(zhuǎn)移間的關(guān)系[J].中國腫瘤生物治療雜志，2009，16(1)：80-83.