白血病抑制因子受體過表達(dá)對肺癌干細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

姜琪，任雪松，劉春華，張艷，湯秦

(1四川綿陽四○四醫(yī)院，四川綿陽621000；2綿陽市中心醫(yī)院)

腫瘤干細(xì)胞是一類具有自我更新、無限增殖、多向分化能力的細(xì)胞，是腫瘤無限生長的主要原因，也是惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療耐藥的根本原因[1～3]。肺癌干細(xì)胞(LCSC)表面表達(dá)跨膜糖蛋白(CD133)、Ⅰ類跨膜糖蛋白(CD44)、醛脫氫酶(ALDH)、胰島素樣生長因子1(IGF1)和胰島素樣生長因子1受體(IGF1-R)等，流式細(xì)胞術(shù)可據(jù)此分選LCSC[4]。白血病抑制因子受體(LIFR)基因在多種惡性腫瘤組織中存在表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象[5]，而LIFR過表達(dá)可抑制多種腫瘤進(jìn)展，如乳腺癌和肝癌等[6，7]。目前鮮見LIFR過表達(dá)對LCSC凋亡影響的報(bào)道。2016年3月～2017年10月，本研究觀察了LIFR過表達(dá)對LCSC凋亡的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3單抗和兔抗人GAPDH多抗(CST，美國)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(博士德生物工程有限公司，湖北武漢)，PE標(biāo)記的CD133流式抗體CD133-PE(BD，美國)，LIFR慢病毒載體質(zhì)粒及對照空載體質(zhì)粒(GeneCopoeia構(gòu)建，美國)，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑(Invitrogen，美國)，RNA抽提試劑盒(Applied Biosystems，美國)，TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Life Technologies,英國)，qSYBR-Green-containing PCR試劑盒(Qiagen,美國)，Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物技術(shù)股份有限公司，江蘇)，蛋白提取試劑盒、ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒(Thermo，美國)，ChemiDocTM觸摸成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA，配合Image LabTMTouch軟件Version1.0使用)，IX71奧林巴斯倒置顯微鏡(Olympus公司，日本，CCD圖像傳感器，配合Image-Pro Plus7.0成像系統(tǒng)使用)，紫外可見分光光度計(jì)(Thermo，Nanodrop2000，美國)，BD FACSAriaTM流式細(xì)胞分選儀(BD，美國)。

1.2 LCSC分選和培養(yǎng) 肺癌組織標(biāo)本取材于四川綿陽四○四醫(yī)院收治的1例肺癌患者原發(fā)灶，病理類型為腺癌。該患者于2016年12月在該院接受治療，男性，42歲，無其他基礎(chǔ)疾病，術(shù)前未進(jìn)行任何抗腫瘤治療，術(shù)中切除的肺癌標(biāo)本經(jīng)病理科確認(rèn)后，無菌條件下迅速置于RNAlater保存液中，-80 ℃保存。所有過程遵從赫爾辛基宣言標(biāo)準(zhǔn)，研究方案經(jīng)該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在充分告知可能存在的風(fēng)險(xiǎn)后，該患者簽署了知情同意書。無菌條件下取術(shù)中獲得的人肺癌原發(fā)灶標(biāo)本約2.5 cm3，置于裝有Hanks液的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，漂洗3 min×2次，用眼科彎剪將組織剪成大約1 mm3的小塊，加入1%膠原消化液于室溫下消化0.5 h，將細(xì)胞懸液過0.45 μm的細(xì)胞篩，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清，共離心2次。最后調(diào)整單細(xì)胞懸液密度為1×107個(gè)/mL。取2 mL單細(xì)胞懸液接種于25 mL的培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)基含DMEM-F12(1∶1)500 mL、B27(1∶50)10 mL、20 ng/mL表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)各500 μL。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，室溫下1 000 r/min 離心5 min，棄上清。PBS清洗2次，1 000 r/min離心5 min，用PBS調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/mL，將細(xì)胞平均分為兩份，分別移至流式管中，一份加入CD133-FITC抗體，一份加入FITC及PE標(biāo)記的對照抗體，各加入10 μL，加入FcR阻斷劑20 μL，緩沖buffer 80 μL，充分混勻后，4 ℃條件下避光靜置15 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗1次，棄上清，用流式細(xì)胞儀分選出CD133+肺癌細(xì)胞亞群，即為LCSC。LCSC培養(yǎng)于含無血清培養(yǎng)基的低吸附6孔板中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每5天加入新鮮培養(yǎng)基1.5 mL以補(bǔ)充干細(xì)胞生長所需的生長因子和營養(yǎng)，當(dāng)干細(xì)胞球數(shù)量為200～300個(gè)時(shí)傳代，取傳3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 穩(wěn)定過表達(dá)LIFR的LCSC構(gòu)建 將含LIFR的重組慢病毒質(zhì)粒及其陰性對照慢病毒空載體質(zhì)粒control(均帶EGFP熒光標(biāo)簽)分別以病毒/細(xì)胞數(shù)量為18的比例感染LCSC，3 天后觀察熒光的表達(dá)量，并加入2.0 μg/mL嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)1周，所有細(xì)胞可觀察到熒光表達(dá)，證實(shí)穩(wěn)定過表達(dá)LIFR的LCSCLIFR及其陰性對照LCSCcontrol構(gòu)建成功。

1.4 LIFR mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。分別取LCSCLIFR及LCSCcontrol，消化后離心，棄上清，收集沉淀。向沉淀中加入1 mL TRIzol，室溫孵育15 min裂解細(xì)胞，4 ℃下12 000 r/min離心 15 min，取上清，每毫升TRIzol加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，冰上孵育15 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，緩慢取上清，避免吸入中間層的白色物質(zhì)，上層水相體積約為所用TRIzol試劑的60%，將吸取的上清置于另一干凈EP管內(nèi)，加入等體積的異丙醇沉淀水樣中的RNA，顛倒混勻，4 ℃下12 000 r/min離心15 min,見RNA沉淀附著于EP管，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃下7 500 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥，加入30 μL無RNase水溶解，取1 μL測RNA濃度和純度，剩余RNA立即放入-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ陨鲜鎏崛〉募?xì)胞總RNA為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以cDNA為模板，按qSYBR-Green-containing PCR試劑盒的說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)體系體積20 μL，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。LIFR引物由Invitrogen公司合成。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LIFR mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞凋亡率檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。取培養(yǎng)至第3代的LCSCLIFR及LCSCcontrol，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于6 cm培養(yǎng)皿中，每皿5 mL。培養(yǎng)48 h后PBS清洗3次，加入0.25%胰酶，吹打至懸浮狀態(tài)，每皿加入100 μL緩沖液、5 μL Annexin Ⅴ-FITC及5 μL 0.5 mg/L PI，4 ℃避光靜置15 min，于流式細(xì)胞儀上檢測各組細(xì)胞凋亡情況。統(tǒng)計(jì)右下和右上象限的數(shù)值之和(早期凋亡與晚期凋亡細(xì)胞之和)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。按照蛋白提取試劑盒、ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別提取細(xì)胞總蛋白并測定蛋白濃度。取蛋白樣本30 μg，進(jìn)行10%SDS-PAGE，電泳結(jié)束將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5% BSA室溫封閉1～2 h，分別加入1∶100 000的兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3和內(nèi)參GAPDH抗體，4 ℃過夜。用TBST洗膜10 min×3次，二抗孵育，1∶1 000二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔)，室溫孵育1 h，隨后TBST洗膜10 min×3次。最后加入ECL發(fā)光劑并曝光，采用ChemiDocTM觸摸成像系統(tǒng)掃描并保存蛋白條帶的圖片，Quantity One軟件分析，以目的蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3電泳條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 LCSCLIFR及LCSCcontrolLIFR mRNA相對表達(dá)量比較 LCSCLIFR及LCSCcontrolLIFR mRNA相對表達(dá)量分別為8.54±1.32、1.03±0.02，兩組比較P<0.05。

2.2 LCSCLIFR及LCSCcontrol細(xì)胞凋亡率比較 LCSCLIFR及LCSCcontrol細(xì)胞凋亡率分別為(35.00±5.29)%、(11.33±1.76)%，兩組比較P<0.05。

2.3 LCSCLIFR及LCSCcontrolBcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較 與LCSCcontrol相比，LCSCLIFRBcl-2蛋白相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量明顯升高(P均<0.05)。見表1。

3 討論

大量研究顯示，腫瘤細(xì)胞中存在一小部分可維持腫瘤細(xì)胞異常生長的亞群，這群細(xì)胞具有無限增殖和多向分化能力，被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根本原因，即為腫瘤干細(xì)胞[8]。

表1 LCSCLIFR及LCSCcontrol Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較

注：與LCSCcontrol比較，*P<0.05。

LIFR是極其重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，其在多種腫瘤中存在表達(dá)失調(diào)現(xiàn)象，如在肺癌和乳腺癌中均存在表達(dá)缺失現(xiàn)象，且其表達(dá)缺失與乳腺癌的淋巴結(jié)陽性狀態(tài)、腫瘤分級增加、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加及總體生存率降低密切相關(guān)[9，10]。本研究選擇CD133為分選標(biāo)志物基于以下考慮：①CD133跨膜糖蛋白是頂端質(zhì)膜上重要的細(xì)胞膜蛋白，是多種腫瘤干細(xì)胞分選及鑒別的分子標(biāo)志物，如白血病和膠質(zhì)瘤均選擇CD133為分選標(biāo)志物[11，12]；②采用流式分選技術(shù)以CD133為LCSC分選標(biāo)志物，分選出的LCSC具有增殖能力顯著增強(qiáng)、有多向分化特性、對多種化學(xué)抗癌或靶向抗癌藥物的治療產(chǎn)生顯著的耐藥性的特點(diǎn)[13]。本研究通過慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法篩選并成功構(gòu)建了LCSCLIFR及LCSCcontrol細(xì)胞株，證實(shí)LCSCLIFR細(xì)胞株LIFR mRNA相對表達(dá)量明顯高于LCSCcontrol，表明LCSCLIFR細(xì)胞確實(shí)存在LIFR過表達(dá)。LCSCLIFR細(xì)胞凋亡率明顯高于LCSCcontrol細(xì)胞，表明過表達(dá)LIFR可促進(jìn)LCSC細(xì)胞凋亡。LCSC細(xì)胞受到抑制的細(xì)胞凋亡機(jī)制被重新激活，這有助于降低LCSC的惡性程度，進(jìn)而降低其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

Bcl-2、Bax和Caspase-3是最重要的3個(gè)凋亡相關(guān)蛋白，其中Bax和Caspase-3是重要的促凋亡因子，Bcl-2是重要的凋亡抑制因子，Bcl-x、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)和活性水平可反映腫瘤細(xì)胞的凋亡狀態(tài)，也是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡水平變化的原因[14，15]。已有研究證實(shí)，Bax和Bcl-2是調(diào)控細(xì)胞凋亡活動(dòng)的重要胞內(nèi)蛋白質(zhì)，兩者在腫瘤的發(fā)生及惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[16]。Caspase-3則是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心蛋白酶，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)最重要的執(zhí)行者，是在各種原因及因素引起的凋亡活動(dòng)中起最終樞紐作用的蛋白[17]。Bcl-2家族蛋白是一種具有雙重調(diào)控功效的蛋白，既可促進(jìn)細(xì)胞凋亡(如Bax)，又可促進(jìn)細(xì)胞增殖并阻止細(xì)胞凋亡(如Bcl-2)[18]。研究顯示，Bcl-2為癌基因，可通過阻礙細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)、抑制Caspase蛋白水解而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用[19]。Bax為Bcl-2的抑制因子，兩者之間或單獨(dú)可形成異源或同源二聚體，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡活動(dòng)，兩個(gè)Bax的同源二聚體可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2和Bax的異源二聚體則抑制細(xì)胞的凋亡能力[20]。若Bcl-2/Bax 比例降低則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，LCSCLIFRBax和Caspase-3蛋白相對表達(dá)量明顯高于LCSCcontrol，而Bcl-2蛋白相對表達(dá)量明顯低于LCSCcontrol，即Bcl-2/bax比例顯著降低；LCSCLIFR細(xì)胞凋亡核心調(diào)控蛋白Caspase蛋白表達(dá)明顯高于LCSCcontrol，細(xì)胞凋亡率亦高于LCSCcontrol，說明LIFR過表達(dá)對LCSC的抑制作用可能是通過增加Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)、抑制Bcl-2蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，而LIFR調(diào)控上述凋亡相關(guān)蛋白的具體途徑還需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

綜上所述，LIFR過表達(dá)可促進(jìn)LCSC細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制Bcl-2蛋白表達(dá)、促進(jìn)Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。臨床可針對上述靶點(diǎn)研發(fā)相應(yīng)藥物。

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