百里醌通過磷酸化p38MAPK途徑介導NSCLC細胞毒性作用的機制研究

陳子盛,廖小雯,張亦飛,肖靖華,陳 蕓,劉清霞,王 鵬,車鵬彪,朱連雨,田東波

(1.廣州醫科大學附屬第六醫院/清遠市人民醫院 呼吸二病區,廣東 清遠,511500; 2.廣東省五邑中醫院 神經內科,廣東 江門,529000)

肺癌是目前全球最常見的惡性腫瘤之一，研究[1]表明2012年全球新發肺癌患者1.82/百萬，死亡1.59/百萬，肺癌約占所有腫瘤相關性死亡的18%。非小細胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80%～85%,Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC單純根治術后5年存活率約70%,而晚期NSCLC 5年存活率<5%[2]。目前中國晚期NSCLC除針對驅動基因精準靶向治療，最常用一線化療是含鉑兩藥方案，即長春瑞濱、吉西他濱、多西他賽、紫杉醇、替吉奧聯合鉑類，復發轉移、治療失敗的NSCLC,通常是對以鉑類為基礎的化療方案不應答或耐藥[3],因而急需尋找新治療方法，以降低一線方案耐藥或提供有效穩定新靶點。

百里醌(TQ))是黑種草籽(Nigella damascena)揮發油的主要生物活性成分，有研究[4-5]表明TQ具有抗炎、抗氧化、抗高血壓、抗菌、抗哮喘、抗腫瘤等功效,TQ能抑制乳腺癌、白血病、黑色素瘤、結腸癌、宮頸癌、多耐藥卵巢癌、前列腺癌細胞增殖，且減少順鉑化療方案不良反應如心肌損傷[6],并對正常細胞具有較高劑量耐受性[7],提示TQ具有較好安全性，有望成為NSCLC治療選擇。本研究探討TQ對NSCLC毒性作用的分子機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與細胞培養

SK-MES-1、95-D肺鱗癌細胞和A549肺腺癌細胞，均購自中國科學院細胞庫(上海)，TQ(純度≥98%)、U0126和SB203580均購自Sigma,實驗所需抗體p-p38、p38，p-ERK1/2、ERK1/2，p-JNK、JNK,β-actin均購自Cell Signaling Technology，化學發光試劑盒購自Millipore。SK-MES-1、95-D、A549培養條件均為: DMEM培養基(高糖，含10%胎牛血清，不加雙抗),5%CO2,37.0 ℃。

1.2 實驗設計及分組

采用DMSO溶解TQ后配成100 mmol/L,按梯度稀釋法配成工作液濃度，對照組加入同體積的DMSO。

1.3 MTT測細胞毒性

SK-MES-1、95-D、A549細胞接種于96孔板,5 000個/孔，細胞貼壁后同步化12 h,分別加20、40、60、80、100 μmol/L的TQ，每個濃度設6復孔，孵育24 h后吸掉培養基，每孔加PBS稀釋的1×MTT液100 μL培養4 h,棄上清，每孔加100 μL DMSO，震蕩使結晶充分溶解，酶標儀570 nm測吸光度OD值，細胞存活率%=OD實驗組/OD對照組×100%,利用excel回歸方程計算TQ的IC50值。SK-MES-1時間依賴性實驗細胞接種密度同上，予約TQ IC50濃度分別作用10 min、24 h、48 h,MTT檢測方法如上計算細胞存活率。

1.4 Western blot實驗

將指數生長期的SK-MES-1細胞接種于10 cm2培養皿，密度為1.5×106個/皿，貼壁后同步化12～16 h，處理組予10 μmol/L的U0126預處理1 h后加入TQ孵育30 min，對照組予DMSO處理，提取總蛋白，采用BCA法測樣品總蛋白濃度，按Western blot實驗方法進行電泳、轉膜、5%脫脂牛奶封膜，一抗為羊抗兔p-p38、p38,p-ERK1/2、ERK1/2，p-JNK、JNK，4℃孵育過夜或者室溫1 h，TBST清洗后室溫下兔二抗孵育30 min，最后利用化學發光試劑盒顯影并采集圖像。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 不同濃度TQ對NSCLC細胞毒性作用

分別予20、40、60、80、100 μmol/L TQ孵育SK-MES-1細胞24 h,可見TQ呈濃度依賴性發揮細胞毒性作用，通過Excel回歸方程式計算,TQ IC50≈66 μmol/L,予60 μmol/L TQ分別作用10 min、24 h、48 h,可見TQ呈時間依賴性發揮細胞毒性作用(圖1A、B),擴展至95-D和A549細胞，同樣觀察到TQ呈濃度依賴性降低細胞存活率(圖1C、D)。

A.TQ呈濃度依賴性發揮SK-MES-1細胞毒性作用,***P=0.000;

B.TQ呈時間依賴性發揮SK-MES-1細胞毒性作用,***P=0.000;

C.TQ呈濃度依賴性發揮95-D細胞毒性作用,***P=0.000;

D.TQ呈濃度依賴性發揮A549細胞毒性作用,*P<0.05,**P<0.01。

圖1不同濃度TQ對NSCLC的細胞毒性作用

2.2 TQ通過p38途徑介導NSCLC細胞毒性作用

為驗證TQ是否通過p38途徑介導NSCLC細胞毒性作用，對照組予30和60 μmol/L TQ作用于SK-MES-1 1h; 實驗組分別予10 μmol/L U0126和10 μmol/L SB203580預處理1 h后，分別加入30和60 μmol/L TQ 1 h,吸掉含藥培養基，加正常培養基，培養24 h后行MTT檢測。結果表明,30 μmol/L TQ和10 μmol/L U0126+30 μmol/L TQ比較其細胞存活率有顯著差異(P=0.000)，但與10 μmol/L SB203580+30 μmol/L TQ比較無差異(P=1.00)，10 μmol/L SB203580+30 μmol/L TQ與10 μmol/L U0126+30 μmol/L TQ組比較有顯著差異(P=0.000); 隨著TQ濃度增加，60 μmol/L TQ、10 μmol/L U0126+60 μmol/L TQ、10 μmol/L SB203580+60 μmol/L TQ組兩兩比較，其細胞存活率均無顯著差異(P>0.05)，表明即使低劑量TQ狀態下,ERK抑制劑U0126也不能阻斷TQ的細胞毒性作用，即TQ不是通過活化ERK1/2起效，但p38抑制劑SB203580則明顯降低TQ的細胞毒性作用，表明TQ可快速(1 h)通過p38途徑介導細胞毒性作用，可是隨TQ濃度升高接近IC50值,SB203580短暫抑制不能明顯保護SK-MES-1(圖2)。

予10 μmol/L SB203580預處理95-D細胞1 h后，分別加入按梯度稀釋的5～40 μmol/L TQ孵育1 h,換正常培養基培養24 h。10 μmol/L SB203580+40 μmol/L TQ組為10 μmol/L SB203580預處理1 h,加40 μmol/L TQ(≈95-D的TQ IC50值)孵育1 h后，更換含10 μmol/L SB203580的正常培養基培養24 h。MTT結果表明，隨TQ濃度增加,SB203580對95-D細胞保護作用逐漸減弱,10 μmol/L SB203580+40 μmol/L TQ組與40 μmol/L TQ組比較其細胞存活率仍有顯著差異(P=0.033),表明持續p38抑制仍能明顯降低TQ對95-D細胞毒性作用(圖3)。

?P=0.016, ???P=0.000。圖2 TQ透過p38介導SK-MES-1細胞毒性作用

?P=0.033。圖3 TQ通過p38途徑介導95-D細胞毒性作用

2.3 TQ對NSCLC細胞毒性作用的分子機制

Western blot結果表明U0126能顯著抑制ERK1/2磷酸化,p38隨TQ濃度增加而磷酸化增加，但ERK1/2磷酸化減少,JNK磷酸化無明顯變化，表明TQ通過磷酸化p38介導細胞毒性作用，而不是ERK1/2(圖4)。

圖4 TQ對NSCLC細胞毒性作用的分子機制

3 討 論

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一組絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，刺激信號如生長因子、細胞因子、射線、基因毒性化療藥、應激、滲透壓等均可激活MAP3K,產生級聯效應，活化MAPK(ERK、JNK/SAPK、p38),MAPK一旦被胞外刺激信號激活將廣泛調節細胞增殖、遷移、凋亡、分化和衰老[8]。許多化療藥需激活p38才能發揮作用，通過重新激活p38誘導癌細胞凋亡被認為是治療NSCLC的重要途徑之一[9],p38活化增強化療敏感性，促進癌細胞凋亡，引起癌細胞周期停滯，抑制癌細胞生長和分化[10],比如在乳腺癌細胞中環磷酰胺、結腸癌細胞中奧沙利鉑均通過活化p38通路而誘導癌細胞凋亡[11-12],依托泊苷增加NSCLC細胞MKK3/6-p38的磷酸化[13],活化的p38通過滅活Met受體增強順鉑化療敏感性[14]。

TQ具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等功效，本研究表明TQ呈濃度及時間依賴性發揮NSCLC細胞毒性作用。為進一步驗證TQ是否通過p38途徑介導NSCLC細胞毒性效應，予10 μmol/L U0126和10 μmol/L SB203580預處理SK-MES-1,抑制ERK1/2和p38磷酸化，加入30 μmol/L TQ后孵育1 h后更換正常培養基培養24 h,結果表明U0126并不能防止TQ對SK-MES-1的毒性作用，但SB203580卻對SK-MES-1有保護作用，其細胞存活率與正常組比較無顯著差異，表明TQ可能通過磷酸化p38介導細胞毒性作用，但當TQ濃度接近IC50值時(60 μmol/L),10 μmol/L SB203580+60 μmol/L TQ組與10 μmol/L U0126+60 μmol/L TQ、60 μmol/L TQ組細胞存活率比較均無顯著差異，表明當TQ達到一定濃度時,SB203580短時間抑制p38不再能阻斷TQ毒性作用。對95-D予接近IC50值的TQ濃度40 μmol/L作用1 h后，更換含10 μmol/L SB203580的培養基培養24 h,與40 μmol/L TQ組比較，細胞存活率顯著增加，表明持續p38抑制明顯降低TQ對NSCLC細胞毒性作用。

進一步探討TQ對NSCLC細胞毒性作用的分子機制，結果表明p38隨TQ濃度增加而磷酸化增加，但ERK1/2磷酸化減少，而JNK磷酸化無明顯改變，表明TQ透過磷酸化p38介導細胞毒性作用，同時抑制ERK1/2介導的細胞增殖信號，并非

如Yang J等[15]表明TQ通過磷酸化ERK1/2抑制NSCLC細胞增殖、遷移、侵襲。

綜上所述,NSCLC細胞基本不表達p-p38,一旦其p38磷酸化，即可誘發NSCLC細胞毒性級聯反應,TQ在短時間內(1 h)就能決定24 h后NSCLC細胞的存亡，同時抑制ERK1/2介導的細胞增殖信號。由此可見,TQ是一種極有前景、值得繼續深入探討的備選抗癌藥或者輔助化療增敏藥。

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